Ахбор

Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript пешкаш хоҳем кард.
Ҳуҷайраҳои саратон механизмҳои гуногунро барои бартараф кардани стрессҳои ҳуҷайравӣ таҳия кардаанд ва пешрафтро идома медиҳанд.Протеинкиназа R (PKR) ва фаъолкунандаи сафедаи он (PACT) посухдиҳандагони аввалия мебошанд, ки сигналҳои гуногуни стрессро назорат мекунанд, ки ба ҷилавгирӣ аз паҳншавии ҳуҷайраҳо ва апоптоз оварда мерасонанд.Аммо, танзими роҳи PACT-PKR дар ҳуҷайраҳои саратон то ҳол номаълум аст.Дар ин ҷо мо дарёфтем, ки РНК-и дарозмуддати рамзгузоришаванда (lncRNA) aspartyl tRNA синтетаза антисенси RNA 1 (DARS-AS1) бевосита дар ҷилавгирӣ аз роҳи PACT-PKR иштирок мекунад ва ба паҳншавии ҳуҷайраҳои саратон мусоидат мекунад.Бо истифода аз скрининги васеъмиқёси функсионалии CRISPRi 971 lncRNA бо саратон, мо дарёфтем, ки DARS-AS1 бо паҳншавии ҳуҷайраҳои саратон ба таври назаррас афзоиш ёфтааст.Аз ин рӯ, нокаут DARS-AS1 паҳншавии ҳуҷайраҳоро бозмедорад ва апоптози ҳуҷайраҳои саратонро дар хатҳои гуногуни ҳуҷайраҳои саратон дар vitro мусоидат мекунад ва афзоиши варамро дар vivo ба таври назаррас коҳиш медиҳад.Ба таври механикӣ, DARS-AS1 мустақиман ба домени фаъолсозии PACT мепайвандад ва ҳамкории PACT-PKR-ро пешгирӣ мекунад ва ба ин васила фаъолсозии PKR, фосфоризатсияи eIF2α ва ҷилавгирӣ аз марги ҳуҷайраҳои апоптозиро коҳиш медиҳад.Аз ҷиҳати клиникӣ, DARS-AS1 дар саратони сершумор ба таври васеъ ифода карда мешавад ва аз ҳад зиёд экспресссияи ин lncRNA аз пешгӯии бад шаҳодат медиҳад.Ин тадқиқот танзими хоси саратони роҳи PACT-PKR-ро аз ҷониби DARS-AS1 lncRNA муайян мекунад ва ҳадафи дигарро барои пешгӯӣ ва табобати саратон таъмин мекунад.
Қобилияти мутобиқ шудан ба стресс хусусияти муҳими зинда мондан ва паҳншавии ҳуҷайраҳои саратон мебошад.Паҳншавии босуръат ва аломатҳои мубодилаи моддаҳои саратон дар муҳити сахти микроорганизмҳо - норасоии маводи ғизоӣ, гипоксия ва рН паст - ба авҷи худ мерасад, ки метавонанд роҳҳои марги ҳуҷайраҳоро ба вуҷуд оранд.Дар саратон номутаносибии генҳои ба стресс ҳассос ба монанди p535, сафедаҳои зарбаи гармӣ 6, 7, KRAS8, 9 ва HIF-110, 11, 12, 13 зуд-зуд мушоҳида мешавад, ки ба ин васила апоптозро бозмедорад ва ба зинда мондан мусоидат мекунад.
Протеинкиназа R (PKR) як сенсори муҳими стресс ва киназаи зербахши омили ибтидоии эукариотӣ 2α (eIF2α), як танзимгари тарҷумаест, ки стресси ҳуҷайраро бо марги ҳуҷайра мепайвандад.PKR дар ибтидо ҳамчун протеини зидди вирусӣ тавассути ошкор кардани РНК-и дукаратаи хориҷӣ (dsRNA) муайян карда шуд.Ҳангоми фаъолсозӣ, PKR eIF2α-ро фосфоризатсия мекунад, то синтези сафедаи вирусӣ ва ҳуҷайраиро боздорад14,15,16.PACT (протеини фаъолкунандаи PKR) ҳамчун аввалин сафедаи фаъолкунандаи PKR дар сурати набудани dsRNA17,18,19,20,21,22,23 муайян карда шудааст.Тавассути ҳамкории мустақим бо PKR, PACT стрессҳои гуногунро (гуруснагии зардоб, пероксид ё табобати арсенит) ба PKR ва роҳҳои сигнализатсияи поёноб интиқол медиҳад.Илова ба фосфоризатсияи eIF2α, фаъолсозии PACT тавассути PKR рӯйдодҳои мухталиферо, ки бо аксуламали стресс алоқаманданд, ба вуҷуд меорад, аз ҷумла тағирёбии ҳолати редокс тавассути роҳи PI3K/Akt24, тафтиши мукаммали зарари ДНК тавассути p5325,26 ва NF-κB27,28 Транскрипсияро танзим мекунад, 29. Бо назардошти нақши муҳими онҳо дар вокуниш ба стресс, паҳншавӣ, апоптоз ва дигар равандҳои асосии ҳуҷайра, PKR ва PACT барои бисёр бемориҳо, махсусан саратон30,31,32,33 ҳадафҳои табобатӣ мебошанд.Аммо, сарфи назар аз ин аҳамияти функсионалии плейотропӣ ва биологӣ, танзими фаъолияти PACT/PKR дар ҳуҷайраҳои саратон номумкин боқӣ мемонад.
lncRNAҳо транскриптҳои калонтар аз 200 нуклеотид мебошанд, ки дорои потенсиали рамзгузории сафеда нестанд.Азбаски лоиҳаҳои пешрафтаи секвенсияи геномҳо ҳазорҳо lncRNA-ро муайян карданд, 35,36 барои равшан кардани функсияҳои биологии онҳо кӯшиши зиёд ба харҷ дода шуд.Маҷмӯи афзояндаи тадқиқот нишон дод, ки lncRNA-ҳо дар бисёр равандҳои биологӣ37, аз ҷумла танзими ғайрифаъолшавии X-хромосома38,39, импринтинг40, транскрипт41,42, тарҷума43 ва ҳатто афзоиши саратон44,45,46,47 иштирок мекунанд.Ин тадқиқотҳо гузориш доданд, ки бисёре аз lncRNAҳо дар роҳи PACT/PKR иштирок мекунанд.Яке аз чунин тадқиқот нишон дод, ки lncRNA ASPACT транскрипсияи PACT-ро бозмедорад ва нигоҳдории ядроии PACT mRNA-ро зиёд мекунад.Таҳқиқоти дигар нишон доданд, ки lncRNA nc886 ба PKR мепайвандад ва фосфоризатсияи онро бозмедорад49,50.То ҳол, дар бораи lncRNA танзимкунандаи фаъолсозии PKR тавассути PACT гузориш нашудааст.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ҳамчун lncRNA51,52,53,54 онкогенӣ муайян карда шудааст.Тавассути танзими miP-194-5p53, miP-12952 ва miP-532-3p51, DARS-AS1 нишон дода шудааст, ки мутаносибан ба афзоиши карциномаҳои ҳуҷайраҳои ҳуҷайраҳои гурда, карциномаҳои сипаршакл ва карциномаҳои хурди шуш мусоидат мекунанд.Тонг ва ҳамкасбон инчунин дарёфтанд, ки DARS-AS1 ба пешрафти миелома тавассути нигоҳ доштани устувории сафедаи 39 (RBM39) мотиви ҳатмии РНК мусоидат мекунад.Аммо, дар бораи он, ки оё ин lncRNA дар танзими фаъолсозии PACT-PKR ва вокуниши стресси ҳуҷайраҳои саратон иштирок мекунад, ягон тадқиқот гузаронида нашудааст.
Дар ин ҷо, мо бо истифода аз системаи CRISPRi экрани миқёси аз даст додани функсияро анҷом додем ва муайян кардем, ки DARS-AS1 lncRNA ба паҳншавии якчанд намуди ҳуҷайраҳои саратон мусоидат мекунад.Илова бар ин, мо як механизми асосиро муайян кардем: DARS-AS1 мустақиман ба PACT мепайвандад, пайвастшавии PACT ва PKR-ро бозмедорад, фосфоризатсияи eIF2α, як субстрати поёнии PKR-ро пешгирӣ мекунад ва дар ниҳоят марги ҳуҷайраҳои апоптозиро бозмедорад.Хулоса, кори мо DARS-AS1 lncRNA-ро ҳамчун танзимгари роҳи PACT-PKR ва ҳадафи эҳтимолии табобат ва пешгӯии саратон ошкор мекунад.
Таҳқиқоти васеъи профили геномӣ садҳо lncRNA-ро, ки бо саратон алоқаманданд, муайян карданд.Бо вуҷуди ин, вазифаи онҳо то ҳол маълум нест56.Барои муайян кардани номзадҳои умедбахши lncRNA, ки дар пешрафти саратон иштирок мекунанд, мо экрани аз даст додани функсияро барои коҳиш додани паҳншавии ҳуҷайраҳои саратони SW620 бо истифода аз системаи CRISPRi анҷом додем (расми 1а).Хусусияти беназири хатҳои ҳуҷайраҳои саратони рӯдаи SW480 ва SW620 дар он аст, ки онҳо аз варамҳои ибтидоӣ ва дуюмдараҷа дар як бемор гирифта мешаванд.Ин муқоисаи арзишмандро барои омӯзиши тағироти генетикӣ дар пешрафти саратони пешрафтаи рӯда таъмин мекунад.Аз ин рӯ, мо транскриптомҳои хатҳои ҳуҷайраҳои саратони колоректалиро (SW480 ва SW620) бо истифода аз пайдарпайии РНК таҳлил кардем ва аз адабиёти нашршуда баъзе lncRNA-ҳои потенсиалии функсионалӣ ҷамъоварӣ кардем.Дар асоси ин натиҷаҳо, мо як китобхонаи муттаҳидшудаи sgRNA-ро тарҳрезӣ кардем, ки дорои 7355 олиго sgRNA, ки 971 lncRNA-ҳои марбут ба саратон ва 500 олигоҳои ҳадафнашудаи sgRNA-ро барои назорати манфӣ ҳадаф доранд (Маълумоти иловагӣ 1).
Намоиши схематикии скрининг бо истифода аз системаи CRISPRi.б ғанисозии sgRNA пас аз скрининг.Хати нуқтаи уфуқӣ log2 (тағйирёбии қат) = ±0,58-ро нишон медиҳад.Хати нуқтаи амудӣ арзиши p = 0,05 -ро нишон медиҳад.Нуқтаҳои сиёҳ sgRNA-и ғайримақсаднокро намояндагӣ мекунанд (ҳамчун NC таъин шудаанд).Нуқтаҳои сурх sgRNA-ҳо мебошанд, ки DARS-AS1-ро ҳадаф қарор медиҳанд.Нуқтаҳои кабуд sgRNA-ҳо мебошанд, ки ба LINC00205, lncRNA-и онкогении қаблан тавсифшуда нигаронида шудаанд.тағирёбии қабат = (хониши муқарраршуда, рӯзи 17) / (хониши муқарраршуда, рӯзи 0).c Ноckdown DARS-AS1 sgRNA афзоиши ҳуҷайраҳоро бозмедорад.Сутунҳои хатогӣ ± инҳирофи стандартии се таҷрибаро ифода мекунанд.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 t-озмоиши ду думдор.d Ифодаи DARS-AS1 дар варамҳо (маҷмӯи додаҳои TCGA).Им ифодаи DARS-AS1 дар намунаҳои ҷуфтшудаи муқаррарӣ ва варамӣ аз беморони гирифтори BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ва COAD мутаносибан (маҷмӯи додаҳои TCGA).Арзишҳои p бо истифода аз t-testи ҷуфти ду-думии Student ба даст оварда шуданд.
Пас аз сохтани плазмид ва бастабандии лентивирус, мо хати ҳуҷайраҳои саратони колоректалии dCas9-SW620-ро бо китобхонаи дар боло овардашуда дар чаҳор озмоиши мустақили сироятӣ интиқол додем.Миқдори сирояти (MOI) барои ин сироятҳо 0,1-0,3 буд, ки нишон медиҳад, ки ҳар як ҳуҷайра танҳо бо як sgRNA интиқол дода мешавад.Пас аз 18 рӯзи фарҳанги in vitro, профили ғанисозии sgRNA-ҳои мақсаднок пас аз скрининг коҳиш ё зиёд шуд, дар ҳоле ки шумораи олигонуклеотидҳои назоратӣ дар муқоиса бо профили пеш аз скрининг нисбатан бетағйир монд, ки нишон медиҳад, ки ҳадафи мо дорои хосияти баланди экран мебошад. китобхона.Райс.1b ва ҷадвали иловагии 1). LINC00205, ки қаблан барои пешбурди саратони шуш ва саратони ҷигар гузориш дода шуда буд58,59,60, аз санҷиш гузаронида шуд (log2 (тағйирёбанда) < -0.58, арзиши p <0.05), эътимоднокии ин ташхисро тасдиқ мекунад (расми 1b). LINC00205, ки қаблан барои пешбурди саратони шуш ва саратони ҷигар гузориш дода шуда буд58,59,60, аз санҷиш гузаронида шуд (log2 (тағйирёбанда) < -0.58, арзиши p <0.05), эътимоднокии ин ташхисро тасдиқ мекунад (расми 1b). LINC00205, ки ба шумо имкон медиҳад, ки пешрафтро ба даст оред, ки легких ва рака печени58, 59, 60, бо истифода аз (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), 1б). LINC00205, ки қаблан гузориш дода шуда буд, ки ба пешрафти саратони шуш ва саратони ҷигар58,59,60 мусоидат мекунад, хориҷ карда шуд (log2 (тағйирёбии баробар) <-0,58, арзиши p <0,05), ки устувории ин скринингро тасдиқ мекунад (расми .1b) . Линдисдсддисдсдрингдсдиссксоз 之前之前 报道 可可 促进肺癌 进展肺癌肝癌 58,59,59,59,59,60, 被 筛 选 掉 (倍数 变化) <-0 掉 掉 掉 掉.58, p 值 <0 筛选 筛选 可靠性 可靠性 可靠性 (图 1). Линдисдсддисдсдрингдсдиссксоз 之前之前 报道 可可 促进肺癌 进展肺癌肝癌 58,59,59,59,59,60, 被 筛 选 掉 (倍数 变化) <-0 掉 掉 掉 掉.58, p 值 <0 筛选 筛选 可靠性 可靠性 可靠性 (图 1). LINC00205, ки ба шумо имкон медиҳад, ки пешрафтро ба даст оред ва печени58, 59, 60, бо истифода аз (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), ки дар он шумо метавонед пешрафт кунед. 1б). LINC00205, ки қаблан гузориш дода шуда буд, ки ба пешрафти саратони шуш ва ҷигар мусоидат мекунад58,59,60, хориҷ карда шуд (log2 (тағйирёбии қабат) <-0.58, арзиши p <0.05), ки устувории ин скринингро тасдиқ мекунад (расми .1b).
Дар байни ҳамаи lncRNA-ҳои санҷидашуда, DARS-AS1 низ тафтиш карда шуд, ки се олигонуклеотидҳои ҳамсояи sgRNA пас аз 18 рӯзи фарҳанг ба таври назаррас коҳиш ёфтанд ва аз он шаҳодат медиҳанд, ки шикастани ин lncRNA боиси коҳиши паҳншавии саратон шудааст (расми 1b).Ин натиҷа аз ҷониби таҳлили MTS дар ҳуҷайраҳои саратони колоректалӣ боз ҳам дастгирӣ карда шуд, ки нишон медиҳад, ки суръати афзоиши ҳуҷайраҳои шикастани DARS-AS1 дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои назоратӣ танҳо ду баробар коҳиш ёфтааст (Расми 1c) ва бо гузоришҳои қаблии якчанд намудҳои дигари саратон мувофиқат мекунад.: саратони гурдаи равшани ҳуҷайра, саратони сипаршакл ва саратони шуши ғайриҳуҷайравӣ51,52,53,55.Бо вуҷуди ин, функсия ва механизмҳои молекулавии он дар саратони рӯдаи рӯда омӯхта нашудаанд.Аз ин рӯ, мо ин lncRNA-ро барои омӯзиши минбаъда интихоб кардем.
Барои омӯзиши ифодаи DARS-AS1 дар беморон, мо 10,327 намунаи варамро аз лоиҳаи саратон Геном Атлас (TCGA) ҳамаҷониба таҳлил кардем.Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 дар ҳуҷайраҳои солим дар варамҳои гуногун ба таври васеъ ифода карда мешавад ва ба таври назаррас танзим карда мешавад, аз ҷумла аденокарциномаҳои рӯдаи ғафс (COAD), карциномаҳои ҳуҷайраҳои равшани гурда (KIRC) ва карциномаҳои папиллярии ҳуҷайраҳои гурда (KIRP)..Хеле кам (расми 1d ва расми 1а, б). Таҳлили намунаҳои ҷуфтшудаи солим / варамҳо минбаъд ифодаи хеле баландтари DARS-AS1-ро дар варамҳои карциномаҳои уротелиалии масона (BLCA), карциномаҳои ҳуҷайраи тозаи гурда (KIRC), аденокарцинома ғадуди простата (PRAD), карциномаҳои сквамоҳуҷайраҳои шуш (LUSC) тасдиқ карданд. , карциномаҳои эндометрияи бачадон (UCEC), аденокарциномаҳои шуш (LUAD), карциномаҳои гепатоцеллярии ҷигар (LIHC), карциномаҳои папиллярии ҳуҷайраҳои гурда (KIRP) ва adenocarcinoma ғафс (COAD) (арзиши p <0,05) (Расми 1e–m) . Таҳлили намунаҳои ҷуфтшудаи солим / варамҳо минбаъд ифодаи хеле баландтари DARS-AS1-ро дар варамҳои карциномаҳои уротелиалии масона (BLCA), карциномаҳои ҳуҷайраи тозаи гурда (KIRC), аденокарцинома ғадуди простата (PRAD), карциномаҳои сквамоҳуҷайраҳои шуш (LUSC) тасдиқ карданд. , карциномаҳои эндометрияи бачадон (UCEC), аденокарциномаҳои шуш (LUAD), карциномаҳои гепатоцеллярии ҷигар (LIHC), карциномаҳои папиллярии ҳуҷайраҳои гурда (KIRP) ва adenocarcinoma ғафс (COAD) (арзиши p <0,05) (Расми 1e–m) .Таҳлили намунаҳои ҷуфтшудаи солим / варамҳо инчунин ифодаи ба таври назаррас баландтари DARS-AS1-ро дар карциномаҳои уротелиалии масона (BLCA), карциномаҳои шаффоф ҳуҷайраҳои гурда ва ҳуҷайраҳои гурда (KIRC), аденокарцинома ғадуди простата (PRAD), карциномаҳои сквамоҳуҷайраҳои шуш (LUSC) тасдиқ карданд., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) ва аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,01e) м). , карциномаҳои эндометрии корпуси бачадон (UCEC), аденокарцинома аз шуш (LUAD), карциномаҳои гепатоцеллярии ҷигар (LIHC), карциномаҳои папиллярии гурда (KIRP) ва аденокарцинома аз рӯдаи рӯда (COAD) (қимати p < 0,05) (расми 1е– м) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 证实 证实 了 了 了 了 了 了 了 尿路 尿路 尿路 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 细胞癌 (krca), 前列 腺腺癌 (LUSC), 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (liad), 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 (Кирп) <0,05）（图1e-m） .配 对 健康 / 健康 的 的 分析 分析 了 了 了 了 了 了 了 了 在 在 在 上 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌皮癌, 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 高 高 高 高 高 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 (LUCE) 肺腺癌 (lifc) 肾 细胞癌 (lhc) 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） (coad) （p 值<0,05）（图1e-m） .Таҳлили намунаҳои ҷуфтшудаи солим / варамҳо минбаъд нақши DARS-AS1-ро дар карциномаҳои уротелиалии масона (BLCA), карциномаҳои ҳуҷайравии ҳуҷайраҳои гурда (KIRC), аденокарциномаҳои простата (PRAD) ва карциномаҳои сквамоҳуҷайраҳои шуш (LUSC) дастгирӣ карданд.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) ва аденокарциноме толстой кишки (COAD) <0,05e. -м). ифода дар саратони бачадон (UCEC), adenocarcinoma шуш (LUAD), карцинома гепатоцеллярӣ (LIHC), карцинома папиллярии ҳуҷайраи гурда (KIRP) ва adenocarcinoma ғафс (COAD) (қимати p <0.05) (Расми 1e -m).Якҷоя гирифта, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 дар намудҳои гуногуни саратон васеъ ва баланд ифода ёфтааст.
Азбаски DARS-AS1 ва DARS (гене, ки риштаи антисенсро рамзгузорӣ мекунад) як промоутерро мубодила мекунанд ва дар паҳлӯи ҳамдигар ҷойгиранд, мо shRNA-ро барои шикастани DARS-AS1 тарҳрезӣ кардем, аммо на DARS (Расми иловагӣ 2a,b ва Ҷадвали иловагии 2) .Илова ба SW620, мо инчунин се хатти ҳуҷайраҳои дигари DARS-AS1-ро барои омӯзиши самаранокӣ ва функсияи шикастани shRNA истифода кардем (Ҷадвали иловагӣ 3).Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки ҳар се shRNA-и таҳияшуда ҳадди аққал 80% самаранокии DARS-AS1-ро бо таъсири кам ба миқдори DARS mRNA ба даст оварданд (Расми иловагӣ 2c-f).Илова бар ин, мо дарёфтем, ки шикастани DARS-AS1 бо ин shRNAs афзоиши ҳуҷайраҳоро дар хати ҳуҷайраҳои саратони колоректалӣ SW620 (49,7%) ва HCT116 (27,7%), хатти ҳуҷайраҳои саратони сина MBA-MD-231 (53,4%) бозмедорад.) ва хати ҳуҷайраи гепатомаи HepG2 (камшавии 92,7%), инчунин қобилияти онҳо дар ташаккули сфераҳои беанчор (камшавии миёнаи ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% ва 75,7% дар як хати ҳуҷайра) (расми 2a,b).Дар SW620, натиҷаҳои таҳлили ташаккули колонияҳо минбаъд тасдиқ карданд, ки DARS-AS1 shRNA паҳншавии ҳуҷайраҳоро бо коҳиши миёнаи тақрибан 69,6% бозмедорад (расми 2c).
Таъсири назорати shRNA ва DARS-AS1 shRNA ба паҳншавии ҳуҷайра (a) ва ташаккули сфероид (б) дар ҳуҷайраҳои SW620, HCT116, MBA-MD-231 ва HepG2.в Таъсири назорати shRNA ва DARS-AS1 shRNA ба ташаккули колония дар ҳуҷайраҳои SW620.Пролифератсияи ҳуҷайраҳо (г), ташаккули сфероидҳо (д) ва ташаккули колонияҳо (f) ҳуҷайраҳои SW620, ки DARS-AS1-ро аз ҳад зиёд ифода мекунанд.Маълумот нишон дода шудааст, ки инҳирояти миёна ± стандартии се таҷриба мебошанд.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, ва *** p ≤ 0,001 аз рӯи t-санҷиш ду думдори Студент.
Барои такмил додани таҳқиқоти аз даст додани функсия, мо минбаъд ҳуҷайраҳои SW620-ро эҷод кардем, ки DARS-AS1-ро аз ҳад зиёд ифода мекунанд (расми иловагӣ 2g).Экспрессияи аз ҳад зиёди DARS-AS1 афзоиши ҳуҷайраҳоро (1,8 маротиба), ташаккули сфероидҳои беканор (1,4 маротиба) ва ташаккули колонияҳоро (3,3 маротиба) дар ҳуҷайраҳои SW620 ба таври назаррас афзоиш дод (расми 2d-f).Мо ин натиҷаро бо истифода аз дигар DARS-AS1, ки хати ҳуҷайраи A549 ифода мекунад, тасдиқ кардем.Ин паҳншавии мукаммали ҳуҷайраҳо аз сабаби аз ҳад зиёди DARS-AS1 дар ҳуҷайраҳои A549 мушоҳида карда шуд (расми иловагӣ 2h, i ва Ҷадвали иловагии 3).Якҷоя, ин таҳқиқоти фоида ва зиён нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 ба паҳншавии ҳуҷайраҳои саратон дар vitro мусоидат мекунад.
Барои омӯхтани механизми асосие, ки тавассути он DARS-AS1 паҳншавии ҳуҷайраҳоро танзим мекунад, мо таҳлили поёнии РНК-ро барои муайян кардани шарикони эҳтимолии пайвасткунандаи сафеда анҷом додем.Натиҷаҳои RT-qPCR нишон доданд, ки тақрибан 86,2% DARS-AS1 дар ситоплазмаи ҳуҷайраҳои SW620 ҷойгир аст (Расми иловагӣ 3a).Пас аз он, DARS-AS1 ё псевдоРНК-и биотинилшудаи in vitro транскрипсияшуда бо лизатҳои ҳуҷайраи SW620 инкубатсия карда шуд ва пас аз ҷудошавии SDS-PAGE.Рангкунии минбаъдаи нуқра нишон дод, ки як банди мушаххас (~ 38 кДа) дар намунаҳои кашидани DARS-AS1 ба таври назаррас бой шудааст, аммо на дар намунаҳои RNA ё маҳтобӣ (расми 3a).Ин банд ҳамчун протеини фаъолкунандаи PKR (PACT) тавассути масс-спектрометрия (MS) муайян карда шуд ва минбаъд тавассути иммуноблот дар хатҳои ҳуҷайраи SW620, HCT116 ва HepG2 тасдиқ карда шуд (расми 3a, b).Ғансозии DARS ва сафедаҳои алоқаманди PACT - PKR ва TRBP - инчунин бо истифода аз таҳлили РНК тавассути Вест blotting (WB) тафтиш карда шуд.Натиҷаҳо нишон доданд, ки ҳеҷ гуна мутақобилаи мустақим байни RNA DARS-AS1 ва ин се сафеда ёфт нашуд (Расми 3b).Муносибати мушаххаси байни DARS-AS1 ва PACT минбаъд тавассути таҳлили иммунопреципиатсияи РНК (RIP) тасдиқ карда шуд, ки нишон дод, ки DARS-AS1 дар антителоҳои зидди PACT ба таври назаррас бой шудааст, аммо на дигар РНК-ҳои назоратӣ (Расми 3c).Барои муайян кардани он, ки DARS-AS1 мустақиман бо PACT дар сурати мавҷуд набудани дигар ҷузъҳои ҳуҷайравӣ, бо истифода аз PACT тозашуда таҳлили интерферометрияи биоқабати in vitro (BLI) анҷом дода шуд.Дар биосенсорҳои стрептавидин (SA) DARS-AS1 ё РНК-и бо тамғаи биотин гузошташуда безарар карда шуд ва сипас дар буфери кинетикии дорои 1 мкм PACT инкубатсия карда шуд.Қобили зикр аст, ки PACT ба DARS-AS1 (қимати KD ~ 26.9 nM) сахт пайваст аст, аммо на ба РНК тақлид мекунад (Расми 3d).Якҷоя гирифта, ин натиҷаҳо ҳамкории мустақим ва наздикии баландро байни DARS-AS1 ва PACT нишон медиҳанд.
Таҳлили кашидани РНК DARS-AS1-ро муайян кард, ки бо PACT дар ҳуҷайраҳои SW620 ҳамкорӣ мекунад.Дар боло, ранг кардани нуқраи сафедаҳои алоқаманд.Иммуноблотҳои поёнӣ бо антителоҳои зидди PACT анҷом дода шуданд.b Таҳлили поёнии РНК дар ҳуҷайраҳои HCT116 (боло) ва HepG2 (поён) анҷом дода шуд.Бо роҳи иммуноблотинг ғанисозии PACT муайян карда шуд.Санҷишҳои иммунопреципиатсияи cRNA (RIP) дар ҳуҷайраҳои SW620 бо истифода аз антителоҳои зикршуда анҷом дода шуданд.d Каҷҳои ҳатмии PACT ба дарозии пурраи DARS-AS1 ё РНК-и назоратӣ бо истифода аз интерферометрияи биоқабатӣ (BLI) ба даст оварда шуданд.РНК дар биосенсори стрептавидин иммобилизатсия карда шуд.Барои чен кардани ассотсиатсия 1 μM PACT истифода шуд.e Санҷиши кашидани РНК бо истифода аз биотинии пурраи DARS-AS1 ё буридашуда (боло) анҷом дода шуд.Иммуноблот, ки PACT гирифта шудааст (поён).f PACT-и парчамбандии тозашуда бо биотинии пурраи DARS-AS1 инкубатсия карда шуд ё бурида шуд (чун дар e) барои санҷиши RIP in vitro.РНК-и истихроҷшуда аз ҷониби RT-qPCR тасдиқ карда шуд.g Наздикии нисбии порчаҳои гуногуни РНК ба PACT бо истифода аз интерферометрияи биоқабат ба даст оварда шуд.Барои таҳлил 100 нМ РНК ва 1 мкм RAST истифода шудааст.h Таҳлилҳои RIP дар in vitro бо истифода аз PACT, ки бо тамғакоғазшудаи покшуда ё буридашуда анҷом дода шуданд.РНК-и истихроҷшуда аз ҷониби RT-qPCR тасдиқ карда шуд.i Суръати афзоиши ҳуҷайраҳои SW620, ки аз ҳад зиёд DARS-AS1, PACT ё ҳардуро ифода мекунанд.j Аз ҳад зиёд ифода кардани DARS-AS1-и пурра ё буридашуда дар ҳуҷайраҳои SW620 ба афзоиши ҳуҷайраҳо таъсири гуногун дошт.к Апоптоз тавассути иммуноблот бо антиденои зидди ПАРП муайян карда шуд.l Нокаут аз DARS-AS1 апоптози ҳуҷайраҳои SW620-ро ба вуҷуд меорад, ки бо цитометрияи ҷараён нишон дода шудааст.Маълумот нишон дода шудааст, ки инҳирояти миёна ± стандартии се таҷриба мебошанд. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, аз рӯи санҷиши t-ду-думии Студент. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, аз рӯи санҷиши t-ду-думии Студент. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 аз рӯи t-санҷишҳои дуҷонибаи Студент. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 аз рӯи t-санҷишҳои дуҷонибаи Студент.
Пас аз он мо се пораи биотинии DARS-AS1 RNA-ро тавассути транскрипсияи in vitro тавлид кардем, то минтақаи DARS-AS1-ро, ки барои ассотсиатсияи PACT лозим аст, муайян кунем (Расми 3e).Натиҷаҳои таҳлили РНК нишон доданд, ки ҳар як порча қодир аст бо PACT мутақобила кунад, аммо минтақаи 3′-терминалӣ (384-768 нуклеотидҳо бо нишони A3) зиёда аз 1-384 нуклеотидҳоро бо нишони A1 нишон доданд (расми 3e).Натиҷаҳои шабеҳ дар таҳлили in vitro RIP бо истифода аз PACT рекомбинантӣ мушоҳида карда шуданд (Расми 3f).Мувофиқи ин натиҷаҳо, таҷрибаҳо барои пайваст кардани порчаҳои РНК-и иммобилизатсияшуда ба PACT бо истифода аз BLI инчунин нишон доданд, ки PACT ба A3 (384–768 nt) наздикии баландтар дорад (қимати KD тақрибан 94,6 нМ), дар ҳоле ки қариб ҳеҷ гуна робита бо дигар минтақаҳо надорад.(расми 3d).
Мо инчунин минтақаҳои алоқамандро дар PACT тафтиш кардем.PACT дорои се домени функсионалӣ мебошад, ки дутои онҳо доменҳои дуқабата-ҳатмии РНК (dsRBD) ва домени сеюм (таъиншудаи D3) мебошанд, ки ҳамчун фаъолкунандаи мутақобилаи сафедаҳо амал мекунанд.Барои тафтиш кардани қобилияти ҳатмии lncRNA-и ҳар як домен, мо се мутацияро таҳия кардем, ки ҳар яке аз се доменро хориҷ карданд ва санҷиши RIP-ро дар vitro анҷом доданд.Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки ҳазфи домени сеюми (D3) PACT таъсири мутақобилаи онро бо DARS-AS1 (дар муқоиса бо PACT солим 0,11 маротиба) дар муқоиса бо ду мутатсияи дигар (расми 3h) ба таври назаррас коҳиш додааст (расми 3h), нишон дода шуд, ки релиз аз D3 бо DARS ҳамкорӣ кард.-AC1.Якҷоя гирифта, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки таъсири мутақобилаи DARS-AS1 ва PACT метавонад асосан тавассути 3' охири DARS-AS1 ва домени D3 PACT ба амал ояд.
Мо қайд кардем, ки DARS-AS1 ба ифодаи PACT ва PACT ба DARS-AS1 таъсире надошт (Расми 3c).Сипас, мо таъсири шикастани PACT-ро ба афзоиши ҳуҷайраҳо тафтиш кардем.Дар муқоиса бо DARS-AS1, ҳуҷайраҳои нисбӣ ҳангоми шикастани PACT 1,5-3 маротиба тезтар афзоиш ёфтанд (Расми 3d).Натиҷаҳои таҳлили ташаккули колония нишон доданд, ки ҳуҷайраҳо пас аз коркарди shRNA бо PACT колонияҳои 2-3-карата ташкил карданд (Расми иловагӣ 3e).Барои санҷидани он, ки DARS-AS1 паҳншавии ҳуҷайраҳоро тавассути PACT танзим мекунад, мо ҳуҷайраҳои SW620-ро тавлид кардем, ки PACT, DARS-AS1 ё ҳардуро аз ҳад зиёд ифода мекунанд.Аз ҳад зиёд экспресссияи PACT монеаи назарраси паҳншавии ҳуҷайраҳоро нишон дод (Тасвири 3i).Дар ҳоле ки экспрессияи аз ҳад зиёди DARS-AS1 ба таври назаррас ба паҳншавии ҳуҷайра мусоидат мекард, дар суръати афзоиши ҳуҷайраҳои аз ҳад зиёд ифодакунандаи DARS-AS1 ва PACT фарқияти назаррас вуҷуд надошт.Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки PACT метавонад ба паҳншавии афзояндаи аз ҳад зиёди DARS-AS1 муқобилат кунад.
Азбаски минтақаҳои гуногуни DARS-AS1 дорои қобилиятҳои гуногуни ҳатмии PACT мебошанд, мо таъсири нисбии онҳоро ба паҳншавии ҳуҷайраҳо тавассути аз ҳад зиёди порчаҳои DARS-AS1 тафтиш кардем.Дар муқоиса бо ду порчаи дигар, DARS-AS1 дар охири 3' (384-768 nt), минтақаи асосии марбут ба PACT дар DARS-AS1, ки қобилияти баландтарин барои ҳавасмандкунии паҳншавии ҳуҷайраҳо дошт (расми 3j).Ин натиҷаҳо таносуби мусбатро байни қобилияти ҳатмӣ ва функсияи биологии DARS-AS1 нишон медиҳанд.
Гузориш шудааст, ки PACT як протеини апоптозӣ мебошад19.Аз ин рӯ, мо таъсири DARS-AS1-ро ба апоптоз тафтиш кардем.Тавре ки интизор мерафт, шикастани DARS-AS1 ҷудошавии PARP-ро дар ҳуҷайраҳои SW620 ба таври назаррас афзоиш дод ва ҳиссаи ҳуҷайраҳои V-мусбатро дар SW620, HCT116, HepG2 ва MBA-MD-231 зиёд кард (расми 3k).3).3f-h), нишон медиҳад, ки таъсири зидди апоптозии DARS-AS1 дар ҳуҷайраҳои саратон ба функсияи апоптозии PACT муқобил аст.Якҷоя, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки механизми функсияи онкогении DARS-AS1 метавонад тавассути ҷилавгирӣ аз функсияи PACT бошад.
Баъдан, мо оқибатҳои функсионалии ассотсиатсияи DARS-AS1-PACT-ро таҳқиқ кардем.Гузориш шудааст, ки PACT PKR-ро тавассути ҳамкории мустақим фаъол мекунад, ки баъдан фосфоризатсияи eIF2α-ро тақвият медиҳад ва боиси ҳазфи тарҷума ва апоптоз мегардад17.Аввалан, мо тафтиш кардем, ки DARS-AS1 ба маҳаллисозии ҳуҷайравии PACT ва PKR таъсир мерасонад.Микроскопияи флуоресцентии конфокалӣ нишон дод, ки PACT ва PKR дар ҳуҷайраҳои SW620 бо коэффисиенти миёнаи коррелятсияи Пирсон 0,72 хеле колокализатсия шудаанд.Дар ҳамин ҳол, ифодаи аз ҳад зиёди DARS-AS1 ҳамҷойшавии PACT ва PKR-ро ба таври назаррас коҳиш дод (коэффисиенти коррелятсияи Пирсон 0.61) (Расми 4а).Барои тафтиш кардани он, ки оё DARS-AS1 метавонад таъсири мутақобилаи PACT-PKR-ро тағир диҳад, мо таҳлили ко-иммунопреципитация (ко-IP) бо антителоҳои зидди PACT дар лизатҳои ҳуҷайраи SW620 анҷом додем.PKR бо анти-PACT дар ҳуҷайраҳои назоратӣ хеле ғанӣ шуд, дар ҳоле ки барқароршавии PKR дар лизатҳо аз ҳуҷайраҳои аз ҳад зиёд ифодакунандаи DARS-AS1 ба таври назаррас коҳиш ёфт (расми 4б).PACT ва PKR бо тамғаи софшуда барои санҷишҳои ҳатмии сафеда дар vitro истифода шуданд.Мувофиқи он, онҳое, ки DARS-AS1-ро таъмин карданд, аммо РНК-и назоратӣ надоранд, таъсири мутақобилаи PACT-PKR-ро нишон доданд (Расми 4c).Ҳама натиҷаҳо нишон доданд, ки DARS-AS1 алоқаи PACT ва PKR-ро халалдор кардааст.
Якҷояшавии PACT ва PKR дар ҳуҷайраҳои назоратӣ ё ҳуҷайраҳои аз ҳад зиёд ифодакунандаи DARS-AS1 бо истифода аз микроскопияи флуорессенси конфокалӣ мушоҳида карда шуд.Ядроҳо бо DAPI ранг карда шуданд.Натиҷаҳои оморӣ аз 16 акс гирифта шуданд.б Ко-иммунопреципитация (ко-IP) бо истифода аз антителоҳои зидди PACT дар лизатҳои ҳуҷайраҳои ҳуҷайраҳои назорати SW620 ё ҳуҷайраҳои аз ҳад зиёд ифодакунандаи DARS-AS1.c PACT тамғагузоришуда, PKR-и тозашуда ва дар in vitro бо DARS-AS1 ё РНК-и сохта транскрипсияшуда барои таҳлили ҳатмии сафеда дар in vitro инкубатсия карда шуданд.Барои иммунопреципитация антителоҳои зидди парчам истифода мешуданд.г Иммуноблотҳо бо антителоҳои нишондодашуда дар ҳуҷайраҳои SW620 ва HCT116, ки бо shRNA-и назоратӣ ё DARS-AS1-shRNA трансфексия карда шудаанд, пас аз гуруснагии хуноба анҷом дода шуданд.e Сатҳи ифодаи DARS-AS1 ҳассосияти ҳуҷайраро ба тапсигаргин тағир дод.Ҳуҷайраҳои SW620 бо DARS-AS1 shRNA, плазмиди изофии DARS-AS1 ё плазмиди назоратӣ трансфексия карда шуданд.Ҳуҷайраҳо бо тапсигаргин дар давоми 48 соат коркард карда шуданд ва қобилияти мавҷудияти ҳуҷайраҳо тавассути реагенти MTS муайян карда шуд.f Дар in vitro транскрипсияи DARS-AS1 ё РНК мукаммал ва PACT тозашуда барои таҳлили фаъолсозии in vitro ва муайян кардани иммуноблот истифода шуданд.g Иммуноблотҳо бо истифода аз ин антителоҳо дар ҳуҷайраҳои SW620-ctrl (аз чап) ё ҳуҷайраҳои мутантҳои PKR (аз рост) иҷро карда шуданд.Сипас ин ҳуҷайраҳо бо shRNA-и назоратӣ ё DARS-AS1-shRNA трансфексия карда шуданд ва пас аз гуруснагии хуноба.h Цитометрияи ҷараён нишон дод, ки ғайрифаъолкунии мутант PKR барои апоптоз ба DARS-AS1 дар ҳуҷайраҳои SW620 ҷуброн карда мешавад.i Иммуноблотҳо бо антителоҳои нишондодашуда дар ҳуҷайраҳои SW620 (чап) ё HCT116 (аз рост) анҷом дода шуданд.Ҳуҷайраҳое, ки бо shRNA-и назоратӣ ё DARS-AS1 shRNA трансфексия шудаанд, аз хуноба маҳруманд ва бо ингибитори 100 нМ PKR C16 ё DMSO илова карда мешаванд.Сатри миқёс = 5 микрон.Маълумот нишон дода шудааст, ки инҳирояти миёна ± стандартии се таҷриба мебошанд.* p ≤ 0,05 t-санҷиш ду думдор Студент.
Умуман чунин мешуморанд, ки вақте ки PACT бо PKR17 ҳамкорӣ мекунад, фосфоризатсияи PKR дар Thr451 метавонад ба вуҷуд ояд.Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки сатҳи фосфоризатсияи PKR дар ҳуҷайраҳои шикастани DARS-AS1 пас аз гуруснагии хуноба ба таври назаррас баланд шудааст (Расми 4d ва Расми 4а).Мувофиқи он, мо дарёфтем, ки фосфоризатсияи eIF2α, субстрати асосии PKR, инчунин аз ҷониби DARS-AS1 shRNA ба таври назаррас афзоиш ёфтааст (расми 4d ва расми иловагӣ 4a).Тапсигаргин як стрессори ER мебошад, ки боиси аз ER баровардани Ca2+ мебошад.Табобат бо тапсигаргин гузориш дода шудааст, ки ифода ва фаъолсозии PACT-ро ба вуҷуд меорад, ки минбаъд бо PKR ҳамкорӣ мекунад ва фаъол мекунад ва ба апоптоз тавассути афзоиши фосфоризатсияи eIF2α оварда мерасонад 18,61.Дар ин ҷо, мо тапсигаргинро ҳамчун стимулятори роҳи PACT/PKR истифода бурдем, то тафтиш кунем, ки оё DARS-AS1 метавонад ба ҳуҷайраҳо дар бартараф кардани стресс тавассути ҷилавгирӣ аз роҳи PACT/PKR кӯмак кунад.Мо мушоҳида кардем, ки сатҳи ифодаи DARS-AS1 бо муқовимати ҳуҷайра ба тапсигаргин робитаи мусбӣ дорад.Ҳуҷайраҳои SW620, ки DARS-AS1-ро аз ҳад зиёд ифода мекунанд, ҳангоми табобат бо тапсигаргин беҳтар зинда монданд, дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои бо шикастани DARS-AS1 осебпазиртар шуданд (расми 4e).Мувофиқи ин натиҷаҳо, аз ҳад зиёд экспрессияи DARS-AS1 фосфоризатсияи PKR-ро, ки аз тапсигаргин ба вуҷуд омадааст, коҳиш дод (расми 4b).Баръакси ин, пас аз муолиҷаи тапсигаргин, PKR ва eIF2α дар ҳуҷайраҳои шикастани DARS-AS1 нисбат ба ҳуҷайраҳои назоратӣ ба дараҷаи баландтар фосфоризатсия карда шуданд (Расми иловагӣ. 4b).Ҷолиб он аст, ки тапсигаргин ифодаи DARS-AS1-ро ба таври вобаста ба воя ба вуҷуд овард, ки метавонад функсияи зидди стресси DARS-AS1-ро нишон диҳад (расми 4c).Илова бар ин, мо барои тасдиқи ин мушоҳидаҳо санҷишҳои фаъолсозии vitro анҷом додем.Ба таври мухтасар, PKR аз лизатҳои ҳуҷайра бо истифода аз антиденои зидди PKR тоза карда шуд, сипас бо рекомбинати PACT ва DARS-AS1 дар vitro транскрипсия карда шуд.Пас аз реаксияи ферментативӣ фосфо-ПКР бо истифода аз ВБ муайян карда шуд.Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки фосфоризатсияи PKR аз ҷониби DARS-AS1 ба таври назаррас монеъ шудааст, аммо на аз ҷониби РНК назорат (Расми 4f).Ин натиҷаҳои in vitro ва in vivo нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 фаъолсозии PKR-ро тавассути PACT бозмедорад.Дар айни замон, мо инчунин коҳиши барқарорсозии PACT дар ҳузури DARS-AS1 мушоҳида кардем (Расми 4f).Ин натиҷа бо натиҷаҳои санҷиши ҳатмии сафеда дар vitro мувофиқ аст (Расми 4c) ва боз функсияи бастани DARS-AS1-ро барои ассотсиатсияи PACT-PKR нишон медиҳад.
Ser246 ва Ser287 дар домени D3-и PACT барои фаъолсозии PKR дар зери фишори ҳуҷайра заруранд.Иваз кардани ду пасмондаҳои серин барои аланин мутанти PACT (mutD) дод, ки PKR-ро дар ҳолати набудани стресс фаъол кард ва иваз кардани аланин (mutA) протоколро баръакс кард.Азбаски мо аҳамияти ин доменро дар робитаи мустақим бо DARS-AS1 нишон додем, мо ин ду мутантҳои PACT-ро тавлид кардем, то бисанҷем, ки оё ин пасмондаҳо метавонанд дар ҳамкорӣ бо DARS-AS1 иштирок кунанд.Ҷолиб он аст, ки ҳарду мутантҳо қобилияти пайвастшавӣ ба DARS-AS1-ро аз даст доданд (Расми 4d) ва ин нишон медиҳад, ки сохтори пурраи сафедаи PACT метавонад барои ҳамкории муассир бо DARS-AS1 талаб карда шавад.
Ғайр аз он, натиҷаҳои мо инчунин нишон медиҳанд, ки ҷилавгирӣ аз паҳншавии ҳуҷайраҳои DARS-AS1-shRNA метавонад тавассути аз ҳад зиёд ифода кардани мутант манфии PACT (PACTmutA) ё мутант манфии бартаридоштаи PKR (PKRmut) қисман барқарор карда шавад (Расми иловагӣ. 4e. e).Аз ҳад зиёд экспресссияи мутантҳои бартаридошта-манфии PKR фосфоризатсияи PKR-ро, ки дар натиҷаи шикастани DARS-AS1 ва инчунин фосфоризатсияи eIF2α дар ҳуҷайраҳои аз хуноба маҳрумшуда коҳиш ёфтааст (расми 4g).Муҳимтар аз ҳама, ҳиссаи ҳуҷайраҳои апоптотикӣ, ки дар натиҷаи шикастани DARS-AS1 ба вуҷуд омадаанд, инчунин дар ҳуҷайраҳои аз ҳад зиёд ифодакунандаи PKRmut коҳиш ёфт (расми 4h ва расми иловагӣ 4g).Манъи фаъолияти киназаҳои PKR инчунин функсияи DARS-AS1-ро халалдор мекунад, зеро натиҷаҳо нишон доданд, ки шикастани DARS-AS1 ҳангоми коркарди ҳуҷайраҳо бо ингибитори хоси PKR C16 фосфоризатсияи PKR ва eIF2α-ро хеле кам ба вуҷуд меорад (расми 4i ва расми иловагӣ 4h).).Дар якҷоягӣ, натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 паҳншавии ҳуҷайраҳоро ҳадди аққал қисман тавассути ҷилавгирӣ аз фаъолсозии PACT тавассути PKR мусоидат мекунад.
Барои омӯхтани минбаъдаи нақши DARS-AS1 дар варам, мо таҷрибаҳои vivo бо истифода аз модели ксенографти муш анҷом додем. Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки шикастани DARS-AS1 афзоиши варамҳоро дар мушҳо ба таври назаррас коҳиш додааст (қимати p <0,0001) (расми 5а). Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки шикастани DARS-AS1 афзоиши варамҳоро дар мушҳо ба таври назаррас коҳиш додааст (қимати p <0,0001) (расми 5а). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки шикастани DARS-AS1 афзоиши варамҳоро дар мушҳо ба таври назаррас коҳиш медиҳад (қимати p <0.0001) (Расми 5а).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Натиҷаҳо нишон доданд, ки шикастани DARS-AS1 афзоиши варамҳоро дар мушҳо ба таври назаррас коҳиш додааст (арзиши p <0.0001) (Расми 5а).Ҳамин тариқ, дар гурӯҳи шикастани DARS-AS1, коҳиши назарраси ҳаҷми миёнаи варам тақрибан 72,9% ва массаи миёнаи варам тақрибан 87,8% (Расми 5b-d).Ин натиҷаҳо ба таври қатъӣ нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 метавонад ба афзоиши варам дар vivo ба таври назаррас мусоидат кунад.
Таъсири таблиғоти DARS-AS1 ба онкогенези колоректалӣ дар мушҳои бараҳна.Каҷҳои афзоиш (а), андозаи варам (б), вазн (в) ва тасвирҳои варамҳо (г) нишон дода шудаанд.Барҳои хатогӣ ±SEM-ро ифода мекунанд. n = 10. ****p < 0,0001, аз рӯи санҷиши ду думдори Студент t. n = 10. ****p < 0,0001, аз рӯи санҷиши ду думдори Студент t. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 t-санҷиш ду думдор.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0,0001 t-санҷишҳои дуҷонибаи Студент.e Каплан-Майер таносуби байни сатҳҳои ифодаи DARS-AS1 ва зиндамонии умумиро дар беморони UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM ва LGG таҳлил кард.Сатҳи баланди ифодаи DARS-AS1 дар беморон дар 50% боло буданд;сатҳи пасти ифодаи DARS-AS1 дар беморон дар поёни 50% буд.арзишҳои p бо истифода аз санҷиши рутбаи log муайян карда шуданд.f Модели пешниҳодшуда, ки дар он DARS-AS1 роҳи PACT-PKR ва афзоиши варамҳоро танзим мекунад.
Барои беҳтар фаҳмидани таъсири клиникии DARS-AS1, мо таносуби байни ифодаи он ва зинда мондани беморро тафтиш кардем.Бо таҳлили маҷмӯи додаҳои TCGA, мо дарёфтем, ки ифодаи баландтари DARS-AS1 бо меланомаҳои uveal (UVM), хромофобияи гурда (KICH), карциномаҳои ҳуҷайраҳои папиллярии гурда (KIRP), мезотелиома (MESO), мултиплекс алоқаманд аст.Зиндагии пасттар бо морфози глиобластома (GBM) ва беморони гирифтори глиомаи мағзи сар (LGG) ба таври назаррас алоқаманд буд (Расми 5e).Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 метавонад дар пешрафти варамҳои клиникӣ нақши муҳим бозад ва метавонад биомаркери эҳтимолии пешгӯишаванда дар саратони сершумор бошад.
Дар ин тадқиқот, бо истифода аз скрининги функсионалии миқёси васеи CRISPRi, мо муайян кардем, ки DARS-AS1 lncRNA фишори ҳуҷайраҳои саратонро тавассути танзими ду посухдиҳандаи асосии стресс, PACT ва PKR бартараф мекунад.Бо ҳамкории мустақим бо PACT, DARS-AS1 фаъолсозии PACT бо миёнаравии PKR-ро бозмедорад ва ба ин васила марги ҳуҷайраҳои апоптотикиро пешгирӣ мекунад ва паҳншавии ҳуҷайраҳоро мусоидат мекунад (расми 5f).Тағйирёбии DARS-AS1 дар намудҳои гуногуни саратон мушоҳида шудааст, ки функсияи он барои мусоидат ба зинда мондани ҳуҷайраҳои саратон дар шароити стресс метавонад ба таври васеъ барои намудҳои гуногуни саратон татбиқ карда шавад.
PACT ҳамчун протеини фаъолкунандаи PKR муайян шудааст ва фаъолсозии PKR тавассути PACT дар вокунишҳои стресс тавассути танзими транскрипсия, тарҷума, апоптоз ва дигар равандҳои муҳими ҳуҷайра нақши муҳим мебозад62.Дар тӯли даҳсолаҳо, кӯшишҳо барои фаҳмидани танзими махсуси саратони каскади PACT-PKR карда шуданд.Дар ин ҷо, тадқиқоти мо механизми дигари танзими PACT-PKR-ро дар ҳуҷайраҳои саратон тавассути lncRNA DARS-AS1, ки мустақиман ба PACT мепайвандад, муоширати PACT-PKR-ро бозмедорад, фаъолсозии PKR ва фосфоризатсияи eIF2α-ро бозмедорад ва ба ин васила апоптоз аз стресс ва ҳавасмандгардонии паҳншавии саратон.ҳуҷайраҳо.Ин кашфиёт ба ҳадафҳои эҳтимолии lncRNA барои пешгӯӣ ва табобати саратон равшанӣ меандозад.
Маълумоти мо нишон дод, ки шикастани DARS-AS1 ҳуҷайраҳоро ба гуруснагии зардоб бо афзоиши назарраси фосфоризатсияшудаи PKR ва eIF2α ҳассос мекунад.Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки DARS-AS1 ба зинда мондани ҳуҷайраҳои саратон дар шароити сахт тавассути ҷилавгирӣ аз фаъолияти PACT/PKR мусоидат мекунад.Якчанд РНК-ҳои дигари рамзгузорӣнашаванда, ба монанди ASPACT ва nc886, инчунин дар меҳвари PACT/PKR тавассути паст кардани танзими PACT48 mRNA ё танзими автофосфоризатсия тавассути пайвастшавӣ ба PKR49,50,64 иштирок мекунанд.Дар байни онҳо, DARS-AS1 ҳамчун вайронкунандаи ассотсиатсияи PACT-PKR амал мекунад.Ин тадқиқот фаҳмиши моро дар бораи танзими меҳвари PACT/PKR ва нақши lncRNAs дар вокунишҳои стресс ғанӣ мегардонад.
PACT дорои се домени алоҳида мебошад.Ҳар яке аз ду dsRBD-и аввал барои ба даст овардани пайвастагии баланди PACT ба PKR кифоя аст, дар ҳоле ки домени сеюм (D3) барои фаъолсозии PKR in vitro ва in vivo лозим аст.Таҳқиқоти мо нишон дод, ки DARS-AS1 афзалиятнок бо домени D3 ҳамкорӣ мекунад (расми 3h).Бо назардошти андозаи калони lncRNA (768 нуклеотид), пайвастшавии DARS-AS1 ба D3 метавонад таъсири мутақобилаи байни домени PACT аз dsRBD ва PKR-ро физикӣ боздорад ва ба ин васила ассотсиатсияи PACT ва PKR-ро боздорад.Мутатсияҳои нуқтаи PACT, ки Ser246 ва Ser287-ро дар D3 бо аланин ё аспартат иваз карданд, наздикии ҳатмии онро ба DARS-AS1 вайрон карда, ба аҳамияти хосиятҳои умумии сохторӣ ва электрикии D3 дар ассотсиатсияи онҳо ишора карданд.Тафсилоти бештари ин механизм дар оянда бо истифода аз таҳлили дақиқтари биохимиявӣ ва таҳлили сохтории PACT-и баландсифат талаб карда мешавад.
Таҳқиқоти қаблӣ гузориш доданд, ки DARS-AS1 ба паҳншавии ҳуҷайраҳо тавассути якчанд механизмҳо мусоидат мекунад51,52,53.Дар як мисол, муфаттишон мушоҳида карданд, ки DARS-AS1 гени антисенси сафедаи DARS-ро тавассути ҳадафи miP-194-5p дар ҳуҷайраҳои саратони гурда танзим кардааст.Аммо, дар таҳқиқоти мазкур, шикастани DARS-AS1 ба транскрипсияи DARS дар намудҳои гуногуни саратон, аз ҷумла ҳадди аққал саратони рӯда, сина ва ҷигар таъсири кам дошт.Азбаски lncRNAҳо шакли ифодаи хоси ҳуҷайраҳо ва бофтаҳоро нишон медиҳанд, механизмҳои функсионалӣ дар намудҳои саратон нигоҳ дошта намешаванд, ки метавонанд ба ин ихтилоф байни мушоҳидаҳои мо ва арзёбии қаблии саратонҳои гуногун мусоидат кунанд.Барои равшан кардани механизмҳои мушаххаси равандҳои гуногуни физиологӣ ва патологӣ таҳқиқоти махсус лозим аст.
Таҳлили маълумоти клиникӣ нишон дод, ки ифодаи DARS-AS1 дар варамҳо бо зинда мондани беморони саратон алоқамандии баръакс дорад, ки аҳамияти меҳвари DARS-AS1/PACT/PKR-ро дар пешгӯии саратон таъкид мекунад.Хулоса, тадқиқоти мо нишон медиҳад, ки DARS-AS1 як танзимгари меҳвари сигнализатсияи PACT/PKR мебошад, ба паҳншавии ҳуҷайраҳои саратон мусоидат мекунад ва апоптозро ҳангоми вокуниши стресс бозмедорад, ки як хатти дигари тадқиқотро таъмин мекунад ва барои таҳқиқоти оянда дар бораи табобати эҳтимолӣ таваҷҷӯҳ дорад. .
Хатҳои ҳуҷайраҳои инсонӣ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ва HEK293T аз инфрасохтори миллии захираҳои хати ҳуҷайра дар Чин гирифта шудаанд.Ҳама ҳуҷайраҳо дар муҳити DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) бо 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ва 1% пенициллин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) дар ҳарорати 37 ° C, 5% CO2 нигоҳ дошта шуданд.инкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Анти-ПКР, Абкам (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Анти-Флаг, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));зидди eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);зидди PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);зидди β-тубулин, CST (2128);муши муқаррарӣ IgG, CST (5415S);харгӯш муқаррарӣ IgG, CST (2729S).Антиденоҳо 1:1000 дар PBST барои blotting ғарбӣ ва 1:100 барои IP ҳал карда шуданд.
sgRNAs бо истифода аз асбоби дастраси оммавӣ бо номи CRISPR-ERA66 таҳия карда шуданд.Мо параметрҳои асбоби пешфарзро барои таҳияи sgRNA ва алгоритми ҳисобшудаи сайтҳои ҳатмии sgRNA дар минтақаи 3 кб истифода кардем.марказаш дар TSS.Ҳавзҳои олигонуклеотидҳои sgRNA дар CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) синтез карда шуданд ва ба плазмидҳои инсонии pgRNA клон карда шуданд (Addgene #44248).Ҳамагӣ 12 мкг плазмиди муттаҳидшудаи pgRNA, 7,2 мкг psPAX2 (Addgene # 12260) ва 4,8 мкг pMD2.G (Addgene # 12259) ба 5 x 106 HEK293T дар Трансфексияи 106 бо истифода аз Трансфексияи 108 Трансфексия гузаронида шуданд. ҳуҷайраҳо (CWBIO, Пекин, Чин) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда.Супернатантҳои дорои вирус 48 ва 72 соат пас аз интиқол ҷамъ карда шуданд ва тавассути филтри 0,45 мкм филтр карда шуданд.Барои скрининг, ҳуҷайраҳои SW620, ки сафедаи синтези dCas9/KRAB-ро ифода мекунанд, тавассути интиқоли вирус ба даст оварда шуданд.Ҳуҷайраҳои тағирёфтаи SW620 бо китобхонаи вирус дар чаҳор таҷрибаҳои мустақили сироятӣ дар MOI аз 0,1-0,3 сироят карда шуданд ва бо 2 мкг/мл пуромицин (Сигма, Сент Луис, МО) барои 2 рӯз интихоб карда шуданд.Пас аз он, ҳуҷайраҳо дар тӯли 18 рӯз дар vitro бо фарогирии ҳадди ақали китобхона аз 500 ҳуҷайра/sgRNA барои скрининг парвариш карда шуданд.
ДНК-и геномӣ мувофиқи дастури маҷмӯаи хуни QIAamp DNA Midi (QIAGEN, Дюсселдорф, Олмон; 51183) истихроҷ карда шуд.Дар маҷмӯъ, барои сохтани китобхона 100 мкг ДНК-и геномӣ барои такрори биологӣ истифода шудааст.Минтақаи sgRNA бо ду даври PCR тақвият дода шуд ва ба штрих-код пайваст карда шуд.
Маҳсулоти PCR бо истифода аз gel NucleoSpin® ва маҷмӯаи тозакунии PCR (MACHEREY-NAGEL, Дюрен, Олмон; 740609.250) тоза карда шуданд ва бо истифода аз маҷмӯаи муайянкунии ДНК-и дуқабата Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854) миқдорашон муайян карда шуданд.
Тахлили МТС барои чен кардани афзоиши ҳуҷайраҳо истифода мешуд.Ҳуҷайраҳо дар лавҳаҳои 96-чоҳ бо зичии ибтидоии 2000 ҳуҷайра/чоҳ тухмипошак карда шуданд.Шумораи нисбии ҳуҷайраҳо ҳар рӯз дар вақти нишондодашуда дар тӯли 4-6 рӯз чен карда шуд.Барои ҳар як чоҳ, 20 мкл реагенти MTS (Promega) бо 100 мкл DMEM омехта карда, бо ҳуҷайраҳо барои 4 соат дар 37 ° C инкубатсия карда шуд ва сипас OD490 чен карда шуд.
Имконияти афзоиши беканор тавассути таҳлили ташаккули сфераҳо кашф карда шуд.Ба таври мухтасар, 2000 ҳуҷайраҳои бо shRNA DARS-AS1 трансфексияшуда ё shRNA-и назоратӣ дар микропластинҳои ултра паст (Корнинг) бо тағирёбии миёна ҳар 4 рӯз парвариш карда шуданд.Сфероидхо баъди 14 руз хисоб карда шуданд.500 ҳуҷайраҳои трансфексияшуда бо плазми изофии DARS-AS1 ё плазмиди назоратӣ барои таҳлили такмилдиҳӣ истифода шуданд, вагарна усул бетағйир монд.
РНК бо истифода аз T7 RNA полимераза ва биотин-16-UTP (Roche 1138908910) мувофиқи дастурҳои Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) транскрипт карда шуд.Примерҳое, ки дар ин ҷо истифода мешаванд, дар Ҷадвали иловагии 4 оварда шудаанд.
Минтақаҳои сафедаи рамзгузори PACT ё PKR ба pET15b (Addgene #73619) клон карда шуданд ва ба BL21 (DE3) табдил ёфтанд.Бактерияҳо дар як шабонарӯз дар LB, ки бо ампициллин дода шудааст, инкубатсия карда шуданд ва сипас бо LB тару тоза 100 маротиба маҳлул карда шуданд.Вақте ки OD600-и миёна ба 0,8 расид, 1 мм IPTG барои тавлиди ифодаи сафеда илова карда шуд.Пас аз инкубатсия дар як шабонарӯз бо ларзиши нарм (250 чархзанӣ дар 20 ° C), донаи ҳуҷайра тавассути центрифуга (4000 чархзанӣ, 10 дақиқа, 4 ° C) ҷамъоварӣ карда шуд.Пеллети ҳуҷайраро дар буфери лизис (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) дубора суспенд кунед ва дар ях барои 30 дақиқа инкубатсия кунед, сипас sonicate (15 дақиқа, 5 сония даргир/хомӯш, дар ях) ва центрифуга (13,00) rpm)., 30 дакика, 4°С).Пас аз он супернатант ба қатрони Ni-NTA (QIAGEN) 3 маротиба дар 4°C бор карда шуд, 4 маротиба бо буфери шустан (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) шуста шуд ва 3 маротиба бо миқдори умумӣ элюта карда шуд. буфери 10 мл элюент (50 мм Трис, рН 8.0, 250 мм NaCl, 300 мм имидазол).Протеини тозашуда бо истифода аз WB муайян карда шуд ва консентратсияи он бо истифода аз маҷмӯаи таҳлили протеини Qubit™ муайян карда шуд (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Таҳлилҳои RIP тавре ки қаблан тавсиф шуда буданд, бо тағирот анҷом дода шуданд.Ба таври мухтасар, 1х буфери RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, ингибитори RNasin рибонуклеаза (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 мм DDM, протеаз) костатикии xtostatic xto11ck-ро лиз мекунад. (Roche, 1 mM DTT) ва центрифуга дар 13,000 rpm барои 15 дақиқа дар 4 °C.Пас аз он супернатант бо протеинҳои магнитии A+G (Millipore), ки бо 5 мкг антиденои зидди PACT (Abeam) ё IgG (CST) пайваст карда шудааст, инкуб карда шуд.Дандонҳоро 5 маротиба бо буфери 5х RIP шуста, сипас бо протеиназа K (NEB) ҳазм карданд.RNA бо Trizol истихроҷ карда шуд ва тавассути RT-qPCR муайян карда шуд.Принтерҳо дар ҷадвали иловагии 5 оварда шудаанд.
Санҷиши RIP дар in vitro мувофиқи протоколи стандартии RIP таҳлили тағирёфта анҷом дода шуд.Ҳамагӣ 5 pmol РНК-и транскрипсияшудаи in vitro 1 маротиба бо буфери RIP маҳлул карда шуд ва тавассути инкубатсия дар 65 ° C барои 5 дақиқа ва пас аз хунуккунии суст то ҳарорати хонагӣ гарм карда шуд.Ҳамагӣ 5 pmol сафедаҳои бо парчами PACT-и солим ё мутатсияшуда аз E. coli тоза карда шуданд.Бо РНК-и ренатуризатсияшуда барои 2 соат дар 4°С инкубатсия кунед ва тартиби дар боло зикршударо барои таҳлили RIP барои зидди парчам IP риоя кунед.
Барои таҳлили васеъшавии РНК, ҳуҷайраҳои 1 × 107 бо буфери 1xRIP лизис карда шуданд.Пас аз центрифуга дар 13,000 rpm барои 15 дақиқа дар 4 ° C, супернатант бо 30 мкл маҳтобҳои магнитии стрептавидин (Бекман) барои 2 соат дар 4 ° C коркард карда шуд.Сипас лизати тозашуда бо tRNA хамиртуруш таъмин карда шуд ва бо 40 pmol аз РНК-и ренатуризатсияшуда дар як шабонарӯз дар 4°C инкубатсия карда шуд, сипас барои 2 соати дигар ва 20 мкл маҳтоби магнитии нави стрептавидин, ки бо BSA баста шудааст, илова карда шуд.Қадами шустан аз 4 маротиба бо буфери 5x RIP ва 4 маротиба бо буфери 1x RIP иборат буд.Протеинҳои мувофиқ бо буфери элюционии биотин (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) элюта карда шуданд ва дар NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ҷудо карда шуданд.Пас аз ранг кардани нуқра (Beyotime Biotechnology), бандҳои муайян аз ҷониби MS бурида ва таҳлил карда шуданд.
Таҳлили Co-IP барои санҷиши ҳамкории байни PACT ва PKR гузаронида шуд.Ба таври мухтасар, лизатҳои супернатант бо роҳи инкубатсияи 1 x 107 ҳуҷайраҳои лизишуда дар 1 x буфери RIP ва пас аз центрифуга дар 13,000 rpm барои 15 дақиқа дар 4 ° C омода карда шуданд.Лизатҳо бо протеинҳои магнитии A + G бор карда шуданд, ки бо 5 мкг антиденои зидди PACT пайваст карда шуданд ва дар як шабонарӯз дар ҳарорати 4 ° C мулоим гарданд.Маҳтобҳо 3 маротиба бо буфери 5 × RIP, ду маротиба бо буфери 1 × RIP шуста шуданд ва бо буфери 1 × SDS элюта карда шуданд.Протеини барқароршуда тавассути gel SDS-PAGE таҳлил карда шуд ва аз ҷониби БҶ муайян карда шуд.
Аз E. coli ду пмол ПАКТ ва 1 пмол ПКР тоза карда шуд.Дар буфери 1 × RIP маҳлул кунед ва бо 10 pmol РНК-и ренатуризатсияшуда барои 2 соат дар 4 °C инкубатсия кунед.Пас аз он, онҳо бо протеини A+G бо антителоҳои зидди тамғагузоришудаи магнитии пайвастшуда барои ду соати иловагӣ инкубатсия карда шуданд.Пас аз он маҳтобҳо чор маротиба бо буфери 1x RIP шуста шуданд ва бо буфери 1x SDS элюта карда шуданд.Дар натиҷа PACT ва PKR аз ҷониби БҶ муайян карда шуд.