Ахбор

Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript пешкаш хоҳем кард.
Усулҳои тамғагузории наздикии ферментӣ, ки ба эфирҳои фаъолшуда ё радикалҳои фенокси асос ёфтаанд, барои харитаи протеомҳои зерҳуҷайра ва интерактивҳои сафеда дар ҳуҷайраҳои зинда васеъ истифода мешаванд.Бо вуҷуди ин, эфирҳои фаъолшуда камтар реактивӣ доранд, ки дар натиҷа радиуси васеъи тамғагузорӣ ба вуҷуд меоянд ва радикалҳои фенокси, ки дар натиҷаи коркарди пероксид тавлид мешаванд, метавонанд ба роҳҳои реаксия халал расонанд.Дар ин ҷо мо дар бораи усули вобаста ба фотоактивизатсия (PDPL) дар бораи тамғагузории наздикӣ гузориш медиҳем, ки тавассути ирсияти ирсӣ протеини фотосенсибилизатори miniSOG ба протеини мавриди таваҷҷӯҳ таҳия шудааст.Бо нури кабуд ба вуҷуд омада, бо вақти таъсир назорат карда мешавад, оксигени синглӣ тавлид мешавад ва сипас бо ёрии зонд анилин тамғагузорӣ кардани пасмондаҳои гистидин ба таври фазоӣ ҳал карда мешавад.Мо садоқати баланди онро тавассути харитасозии протеомҳои махсуси органелл нишон медиҳем.Муқоисаи паҳлӯ ба паҳлӯи PDPL бо TurboID фарогирии бештари протеомикии PDPL-ро нишон медиҳад.Баъдан, мо PDPL-ро ба коактиватори транскрипсияи бо беморӣ алоқаманд BRD4 ва E3 Parkin ligase татбиқ кардем ва интерактивҳои қаблан номаълумро пайдо кардем.Бо скрининги аз ҳад зиёд экспрессия, ду субстрати номаълум, Ssu72 ва SNW1 барои Паркин муайян карда шуданд, ки таназзули онҳо тавассути роҳи ubiquitination-proteasome миёнаравӣ мешавад.
Тавсифи дақиқи шабакаҳои сафеда дар асоси бисёр равандҳои асосии ҳуҷайравӣ ҷойгир аст.Аз ин рӯ, харитаи хеле дақиқи фазо-вақтии мутақобилаи сафедаҳо барои кушодани роҳҳои биологӣ, патологияи бемориҳо ва вайрон кардани ин ҳамкорӣ бо мақсадҳои табобатӣ заминаи молекулавӣ фароҳам меорад.Бо ин мақсад, усулҳое, ки қобилияти муайян кардани таъсири мутақобилаи муваққатиро дар ҳуҷайраҳои зинда ё бофтаҳои зинда доранд, хеле матлубанд.Масс спектрометрияи тозакунии наздикӣ (AP-MS) таърихан барои муайян кардани шарикони ҳатмии сафедаҳои манфиатдор (POIs) истифода мешуд.Бо рушди усулҳои протеомикаи миқдорӣ, Bioplex3.0, бузургтарин пойгоҳи додаҳои шабакаҳои сафеда дар асоси AP-MS сохта шудааст.Гарчанде ки AP-MS хеле пурқувват аст, марҳилаҳои лизиси ҳуҷайраҳо ва ҳалкунӣ дар ҷараёни кор ба таъсири мутақобилаи заиф ва муваққатии ҳатмӣ нигаронида шудаанд ва артефактҳои пас аз лизисро ба монанди ҷуфтҳои ҳамкории бардурӯғ, ки пеш аз лизис қисматсозӣ надоранд, ҷорӣ мекунанд.
Барои ҳалли ин масъалаҳо, аминокислотаҳои ғайритабиӣ (UAA) бо гурӯҳҳои пайвасткунанда ва платформаҳои ферментативии тамғагузории наздик (PL) (масалан, APEX ва BioID)5 таҳия шудаанд.Гарчанде ки усули UAA дар бисёр сенарияҳо бомуваффақият татбиқ карда шудааст ва дар бораи часпакҳои мустақими сафеда маълумот медиҳад, оптимизатсияи макони ҷойгиркунии UAA ҳанӯз талаб карда мешавад.Муҳимтар аз ҳама, он як усули тамғагузории стехиометрӣ мебошад, ки тағирёбии каталитикии рӯйдодҳои тамғагузорӣ надорад.Баръакси ин, усулҳои ферментативии PL, ба монанди усули BioID, лигазаи биотини тарроҳиро ба POI7 муттаҳид мекунанд, ки баъдан биотинро фаъол мекунад, то миёнаравии реактивии биотинил-AMP-ро ташкил кунад.Ҳамин тариқ, фермент як биотини фаъолшударо катализ мекунад ва мебарорад, ки пасмондаҳои проксималии лизинро нишон медиҳад.Бо вуҷуди ин, BioID барои ба даст овардани сигнали кофии нишондодашуда зиёда аз 12 соат лозим аст, ки истифодаи онро бо ҳалли муваққатӣ манъ мекунад.Бо истифода аз эволютсияи равонашуда дар асоси дисплейи хамиртуруш, TurboID дар асоси BioID тарҳрезӣ шудааст, то самараноктар бошад ва имкон медиҳад тамғагузории муассир бо биотин дар давоми 10 дақиқа, имкон медиҳад, ки равандҳои динамикӣ омӯхта шаванд.Азбаски TurboID хеле фаъол аст ва сатҳҳои биотини эндогенӣ барои тамғагузории сатҳи паст кифояанд, тамғагузории пасзамина ба мушкилоти эҳтимолӣ табдил меёбад, вақте ки тамғагузории хеле мукаммал ва саривақтӣ бо иловаи биотини экзогенӣ талаб карда мешавад.Илова бар ин, эфирҳои фаъолшуда суст реактивӣ доранд (t1/2 ~5 дақ), ки метавонад ба радиуси бузурги тамғагузорӣ оварда расонад, махсусан пас аз сер шудани сафедаҳои ҳамсоя бо биотин 5. Дар равиши дигар, синтези генетикии пероксидазаи муҳандисии аскорбат (яъне биотин- радикалҳои фенол ва имкон медиҳад тамғагузории сафеда дар давоми як дақиқа 9,10. APEX ба таври васеъ барои муайян кардани протеомаҳои зерҳуҷайраҳо, комплексҳои сафедаи мембрана ва комплексҳои протеини сигналии ситозоликӣ истифода мешавад11,12. Аммо, зарурати консентратсияи баланди пероксидҳо метавонад ба сафедаҳо ё роҳҳои редокс таъсир расонад. равандҳои ҳуҷайра.
Ҳамин тариқ, як усули нав, ки қодир ба тавлиди намудҳои реактивии реактивии реактивии радиус бо дақиқии баланди фазоӣ ва муваққатӣ бидуни халалдор кардани роҳҳои ҳуҷайравӣ як иловаи муҳим ба усулҳои мавҷуда хоҳад буд. Дар байни навъҳои реактивӣ, оксигени синглетӣ бо сабаби умри кӯтоҳ ва радиуси маҳдуди диффузия (t1/2 < 0,6 мкс дар ҳуҷайраҳо)13 таваҷҷӯҳи моро ба худ ҷалб кард. Дар байни навъҳои реактивӣ, оксигени синглетӣ бо сабаби умри кӯтоҳ ва радиуси маҳдуди диффузия (t1/2 < 0,6 мкс дар ҳуҷайраҳо)13 таваҷҷӯҳи моро ба худ ҷалб кард. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни ва ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс дар ҳуҷайраҳо)13. Дар байни шаклҳои фаъол оксигени синглетӣ бо сабаби умри кӯтоҳ ва радиуси маҳдуди диффузия (t1/2 < 0,6 мкс дар ҳуҷайраҳо)13 диққати моро ба худ ҷалб кард.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 中t1/2 < 0,6 µs 1/2 < 0,6 μs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекат синглетный кислород из-за его короткого времени жизни ва радиуси диффузии (t1/2 < 0,6 мкс дар ҳуҷайра). Дар байни шаклҳои фаъол оксигени синглӣ аз сабаби умри кӯтоҳ ва радиуси маҳдуди диффузияаш (t1/2 < 0,6 мкс дар ҳуҷайраҳо) диққати моро ҷалб мекунад.Гузориш шудааст, ки оксигени синглӣ ба таври тасодуфӣ метионин, тирозин, гистидин ва триптофанро оксид карда, онро қутбӣ 14,15 барои пайвастшавӣ ба зондҳои амин ё тиол асос ёфтааст16,17.Гарчанде ки оксигени синглӣ барои нишон додани РНК-и қисмҳои зерҳуҷайра истифода шудааст, стратегияҳо барои бозгардонидани аломатҳои наздикии эндогении POI омӯхта нашудаанд.Дар ин ҷо, мо платформаеро бо номи тамғагузории наздикии фотоактиватсия (PDPL) пешниҳод мекунем, ки дар он мо нури кабудро барои равшан кардани POI-ҳои бо фотосенсибилизатори miniSOG муттаҳидшуда истифода мебарем ва тавлиди оксигени синглеро барои оксид кардани пасмондаҳои проксималӣ истифода мебарем ва пас аз тағир додани аминокислотаҳо барои оксид кардани зондҳои кимиёвӣ дар ҳуҷайраҳои зиндаи мобайнӣ..Мо як гурӯҳи зондҳои кимиёвиро барои ба ҳадди аксар расонидани мушаххасоти тег озмоиш кардем ва бо истифода аз ҷараёни кории кушодаи протеомика сайтҳои тағиротро муайян кардем.Муқоисаи паҳлӯ ба паҳлӯи PDPL бо TurboID фарогирии бештари протеомикии PDPL-ро нишон медиҳад.Мо ин равишро ба маркерҳои хоси органеллҳои протеомаи зерҳуҷайра ва муайянкунии умумии протеомаи шарикони ҳатмӣ барои протеини танзимкунандаи эпигенетикии марбут ба саратон BRD4 ва лигазаи Паркинсон, ки бо бемории Паркинсон E3 алоқаманд аст, татбиқ кардем, ки ҳам шабакаи маълум ва ҳам номаълуми сафедаро тасдиқ кард. мутақобила..Қобилияти PDPL барои эътироф кардани субстратҳои E3 дар комплексҳои калони сафеда вазъиятеро нишон медиҳад, ки эътирофи пайвандҳои бавосита талаб карда мешавад.Ду субстрати номаълуми паркин, ки тавассути ubiquitination-proteasome миёнаравӣ мекунанд, дар ҷои худ тасдиқ карда шуданд.
Терапияи фотодинамикӣ (PDT) 19 ва ғайрифаъолкунии лазерӣ бо ёрии хромофор (CALI) 20, ки дар он радиатсияи рӯшноӣ бо фотосенсибилизаторҳо оксигени синглетро тавлид мекунад, метавонад сафедаҳои мақсаднокро ғайрифаъол кунад ё боиси марги ҳуҷайра гардад.Азбаски оксигени синглет як моддаи хеле реактивӣ буда, масофаи назариявии диффузияи тақрибан 70 нм мебошад, оксидшавии фазои маҳдудро дар атрофи фотосенсибилизатор назорат кардан мумкин аст.Дар асоси ин консепсия, мо тасмим гирифтем, ки оксигени синглетро барои ноил шудан ба тамғагузории наздики комплексҳои сафеда дар ҳуҷайраҳои зинда истифода барем.Мо як равиши химопротеомикии PDPL-ро барои иҷрои чаҳор вазифа таҳия кардем: (1) барои катализ кардани тавлиди оксигени фаъоли синглӣ, ки ба равиши ферментативии PL монанд аст;(2) ҳангоми оғози рӯшноӣ тамғагузории вақтро таъмин кунед;(3) бо тағир додан (4) Барои коҳиш додани замина аз истифодаи кофакторҳои эндогенӣ (ба монанди биотин) худдорӣ кунед ё реагентҳои экзогении хеле изтиробоварро (ба монанди пероксидҳо) истифода баред, то ба ҳадди ақал расонидани таъсири ҳуҷайраҳо ба фишори муҳити зист.
Фотосенсибилизаторҳоро ба ду категория тақсим кардан мумкин аст, аз он ҷумла флюорофорҳои вазни молекулавии хурд (масалан, бенгал, кабуди метилен)22 ва сафедаҳои хурди аз ҷиҳати генетикӣ рамзгузоришуда (масалан miniSOG, KillerRed)23.Барои ноил шудан ба тарҳи модулӣ, мо платформаи насли PDPL-ро тавассути илова кардани сафедаҳои фотосенсибилизатор (PS) ба POI24,25 таҳия кардем (Расми 1а).Вақте ки бо нури кабуд шуоъ карда мешавад, оксигени синглет боқимондаҳои аминокислотаҳои нуклеофилии проксималиро оксид мекунад, ки дар натиҷа як қутби umpolung аст, ки электрофил аст ва минбаъд метавонад бо нуклеофилҳои амин зонд реаксия кунад16,17.Зонд бо дастаки алкин тарҳрезӣ шудааст, то ки химияи кликро иҷозат диҳад ва барои тавсифи LC/MS/MS поён кашад.
Тасвири схемавии тамғагузории комплексҳои сафеда бо миёнаравии miniSOG.Ҳангоми дучор шудан ба нури кабуд, ҳуҷайраҳои ифодакунандаи miniSOG-POI оксигени синглӣ тавлид мекунанд, ки сафедаҳои мутақобилакунандаро тағир медиҳад, аммо сафедаҳои ҳатмӣ надоранд.Маҳсулоти фосилавии фотооксидшавӣ тавассути тамғакоғазҳои релеии зондҳои кимиёвии аминҳо боздошта мешаванд ва иловаҳои ковалентиро ташкил медиҳанд.Гурӯҳи алкинил дар зондҳои химия имкон медиҳад, ки химияро барои ғанисозӣ бо роҳи поён ва пас аз ченкунии LC-MS/MS ғанисозӣ кунад.б Сохтори химиявии зондҳои амин 1-4.в Тахлили намояндагии гели флуоресцентии митохондриалии локализатсияшудаи miniSOG-миёнаравии маркерҳои протеомикӣ бо истифода аз зондҳои 1-4 ва миқдори нисбӣ дар асоси денситометрияи гел.Таносуби сигнал ба заминаҳои зондҳои кимиёвӣ бо истифода аз таҷрибаҳои назорати манфӣ ба истиснои нури кабуд ё бо истифода аз ҳуҷайраҳои HEK293T бидуни ифодаи miniSOG арзёбӣ карда шуд.n = 2 намунаҳои аз ҷиҳати биологӣ мустақил.Ҳар як нуқта як нусхаи биологиро ифода мекунад.d Муайян кардани намояндагӣ ва миқдори PDPL бо истифода аз санҷиши оптимизатсияшудаи 3 дар мавҷудият ё набудани ҷузъҳои зикршудаи PDPL ба монанди в.n = 3 намунаҳои аз ҷиҳати биологӣ мустақил.Ҳар як нуқта як нусхаи биологиро ифода мекунад.Хатҳои марказӣ ва мӯйҳо инҳирофи миёна ва ± стандартиро ифода мекунанд.CBB: Coomassie Brilliant Blue.д Тасвири конфокалии оксигени синглет бо доғи дури Si-DMA.Сатри миқёс: 10 мкм.Таҷрибаҳои тасвири гелӣ ва конфокалӣ мустақилона ҳадди аққал ду маротиба бо натиҷаҳои шабеҳ такрор карда шуданд.
Мо бори аввал қобилияти фотосенсибилизаторҳои баркамол miniSOG26 ва KillerRed23-ро, ки дар HEK293T мӯътадил ифода шудаанд, барои миёнаравӣ кардани тамғагузории пропаргиламини протеом ҳамчун зондҳои кимиёвӣ санҷидем (расми 1а).Таҳлили флуорессенсияи гел нишон дод, ки тамғагузории пурраи протеом бо истифода аз miniSOG ва шуоъдиҳии нури кабуд ба даст оварда шудааст, дар ҳоле ки ягон маҳсулоти тамғагузории намоён бо KillerRed мушоҳида нашудааст.Барои беҳтар кардани таносуби сигнал ба замина, мо пас аз он як қатор зондҳои кимиёвиро санҷидем, ки дорои анилин (1 ва 3), пропиламин (2) ё бензиламин (4) мебошанд.Мо мушоҳида кардем, ки худи ҳуҷайраҳои HEK293T дар муқоиса бо нури кабуд сигнали баландтари замина доранд, эҳтимол аз сабаби фотосенсибилизатори эндогении рибофлавин, мононуклеотиди флавин (FMN) 27. Зондҳои кимиёвии анилин дар асоси 1 ва 3 хусусияти беҳтар доданд ва HEK293T miniSOG-ро дар митохондрия мӯътадил ифода мекунад, ки афзоиши сигналро барои зонд 3 нишон медиҳад, дар ҳоле ки зонд 2 дар усули тамғагузории RNA CAP-seq танҳо ~ 2,5-ро нишон медиҳад. афзоиши сигнали баробар, эҳтимол аз сабаби афзалиятҳои гуногуни реактивӣ байни РНК ва сафеда (расми 1б, в). Зондҳои кимиёвии анилин дар асоси 1 ва 3 хусусияти беҳтар доданд ва HEK293T miniSOG-ро дар митохондрия мӯътадил ифода мекунад, ки афзоиши сигналро барои зонд 3 нишон медиҳад, дар ҳоле ки зонд 2 дар усули тамғагузории RNA CAP-seq танҳо ~ 2,5-ро нишон медиҳад. афзоиши сигнали баробар, эҳтимол аз сабаби афзалиятҳои гуногуни реактивӣ байни РНК ва сафеда (расми 1б, в).Зондҳои кимиёвии анилин дар асоси 1 ва 3 хусусияти беҳтар нишон доданд: HEK293T, ки miniSOG-ро дар митохондрия устувор ифода мекунад, беш аз 8 маротиба афзоиши сигналро барои зонд 3 нишон медиҳад, дар ҳоле ки зонд 2, ки дар усули тамғагузории CAP-seq RNA истифода мешавад, танҳо Эҳтимол аз сабаби афзалиятҳои гуногуни реактивӣ байни РНК ва сафеда афзоиши ~2,5 маротиба афзоиши сигналро нишон медиҳад (расми 1б, в).基于 苯胺 的 化学 化学 探针 探针 探针 探针 探针 和 3 和 3 好 特异性 好 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 增加 增加 增加2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）基于 苯胺 的 化学 化学 探针 探针 探针 探针 探针 和 3 和 3 的 的 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 信号 增加 增加 增加 增加 于 而 于 于 于 于 于 于 于 于 于 2 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAЗондҳои кимиёвии анилин дар асоси 1 ва 3 хусусияти беҳтар доштанд, HEK293T miniSOG-ро дар митохондрия устувор ифода мекард ва зонд 3 сигнал беш аз 8 маротиба афзоиш ёфтааст, дар ҳоле ки зонд 2 барои усули тамғагузории CAP-seq RNA танҳо ~ 2,5 маротиба афзоишро нишон дод.дар сигнал, эҳтимол аз сабаби афзалиятҳои реаксияи гуногун байни РНК ва сафеда (расми 1b, в).Илова бар ин, зондҳои 3 изомерҳо ва зондҳои гидразинӣ (зондҳои 5, 6, 7) озмуда шуданд, ки оптимизатсияи зонд 3-ро тасдиқ мекунанд (Расми 1b,c).Ба ҳамин монанд, таҳлили флуорессенси гель дигар параметрҳои оптимизатсияшудаи таҷрибавиро ошкор кард: дарозии мавҷи шуоъ (460 нм), консентратсияи зондҳои кимиёвӣ (1 мм) ва вақти шуоъ (20 дақиқа) (Расми иловагӣ 2a–c).Нагирифтани ягон ҷузъ ё қадам дар протоколи PDPL боиси бозгашти назарраси сигнал ба замина гардид (расми 1d).Қобили зикр аст, ки тамғагузории протеин дар ҳузури азиди натрий ё тролокс, ки маълум аст, оксигени синглетро хомӯш мекунанд, ба таври назаррас коҳиш ёфт.Мавҷудияти D2O, ки маълум аст, ки оксигени синглетро устувор мекунад, сигнали тамғагузориро беҳтар мекунад.Барои таҳқиқи саҳми дигар намудҳои оксигени реактивӣ ба тамғагузорӣ, маннитол ва витамини С барои таъсиси тозакунакҳои радикалии гидроксил ва супероксид мутаносибан 18, 29 илова карда шуданд, аммо онҳо барои коҳиш додани тамғагузорӣ ёфт нашуд.Иловаи H2O2, аммо равшанӣ нест, ба тамғагузорӣ натиҷа надод (Расми 3а).Тамошои синглҳои оксигени флуоресцентӣ бо зондҳои Si-DMA мавҷудияти оксигени синглетро дар сими HEK293T-miniSOG тасдиқ кард, аммо на дар сими аслии HEK293T.Илова бар ин, mitoSOX Red истеҳсоли супероксидро пас аз равшанӣ муайян карда натавонист (расми 1e ва расми иловагӣ 3b) 30. Ин маълумотҳо ба таври қатъӣ шаҳодат медиҳанд, ки оксигени синглӣ намуди асосии оксигени реактивӣ мебошад, ки барои тамғагузории минбаъдаи протеомик масъул аст.Цитотоксик будани PDPL, аз ҷумла шуоъдиҳии нури кабуд ва зондҳои кимиёвӣ арзёбӣ карда шуд ва ҳеҷ гуна ситотоксикияти назаррас мушоҳида карда нашуд (Расми 4а).
Барои омӯхтани механизми тамғагузорӣ ва имкон додани муайянкунии протеомикии комплексҳои сафедаҳо бо истифода аз LC-MS/MS, мо аввал бояд муайян кунем, ки кадом аминокислотаҳо тағир дода шудаанд ва массаи дельтаи тамғакоғазҳои зонд.Гузориш шудааст, ки метионин, гистидин, триптофан ва тирозин тавассути оксигени синглет тағир дода мешаванд14,15.Мо ҷараёни кории TOP-ABPP31-ро бо ҷустуҷӯи беғаразона, ки аз ҷониби платформаи компютерии FragPipe дар асоси MSFragger32 пешниҳод шудааст, муттаҳид мекунем.Пас аз тағир додани синглҳои оксиген ва тамғагузории зондҳои кимиёвӣ, химияи клик бо истифода аз тамғаи коҳиши биотин, ки дорои пайвандгари ҷудошаванда аст, ва пас аз он дароз кардани нейтравидин ва ҳазми трипсин анҷом дода шуд.Пептиди тағирёфта, ки то ҳол бо қатрон пайваст аст, барои таҳлили LC-MS/MS фотоклив карда шуд (Расми 2а ва Маълумоти иловагии 1).Миқдори зиёди тағирот дар тамоми протеом бо зиёда аз 50 харитаи пептидӣ (PSM) мувофиқат карда шудаанд (расми 2б).Тааҷҷубовар аст, ки мо танҳо тағирёбии гистидинро мушоҳида кардем, эҳтимол аз сабаби реактивии баландтари гистидини оксидшуда ба зондҳои анилин нисбат ба дигар аминокислотаҳо.Мувофиқи механизми нашршудаи оксигени гистидин аз ҷониби оксигени синглет,21,33 сохтори пешниҳодшудаи дельта-массаи +229 Да ба иловаи зонд 3 бо 2-оксо-гистидин пас аз ду оксид мувофиқат мекунад, дар ҳоле ки +247 Да маҳсулоти гидролиз аст. аз +229 Да (расми 5).Арзёбии спектри MS2 эътимоднокии баланди идентификатсияи аксари ионҳои y ва b, аз ҷумла муайянкунии ионҳои фрагментҳои тағирёфтаро (y ва b) нишон дод (расми 2c).Таҳлили контекстии пайдарпаии маҳаллии гистидинҳои бо PDPL тағирёфта афзалияти мӯътадили мотивро барои пасмондаҳои хурди гидрофобӣ дар мавқеъҳои ±1 ошкор кард (Расми 4б).Ба ҳисоби миёна, дар як сафеда 1,4 гистидин муайян карда шуд ва макони ин маркерҳо тавассути майдони сатҳи дастрасии ҳалкунанда (SASA) ва таҳлили мавҷудияти нисбии ҳалкунанда (RSA) муайян карда шуданд (Расми иловагӣ 4c,d).
Ҷараёни кории беғаразона барои омӯзиши интихоби боқимонда бо истифода аз платформаи ҳисоббарории FragPipe, ки аз ҷониби MSFragger таҳия шудааст.Пайвасткунакҳои ҷудошаванда дар химияи клик истифода мешаванд, то ба фотокитоби пептидҳои тағирёфта аз қатрони стрептавидин иҷозат диҳанд.Ҷустуҷӯи кушод барои муайян кардани тағироти сершумор ва инчунин боқимондаҳои дахлдор оғоз карда шуд.б Миқдори тағиротҳое, ки дар тамоми протеом рух медиҳанд, таъин кунед.Харитаи пептидҳои PSM.c MS2 тафсири спектралии маконҳои гистидини бо зонд 3 тағирёфта. Ҳамчун намунаи намояндагӣ, реаксияи ковалентӣ бо зонд 3 ба аминокислотаи аминокислотаи тағирёфта +229,0938 Да илова кард.d Таҳлили мутатсия барои санҷиши аломатҳои PDPL истифода мешавад.PRDX3 (H155A, H225A) ва PRDX1 (H10A, H81A, H169A) бо плазмидҳои навъи ваҳшӣ барои ошкор кардани зидди Парчам трансфексия карда шуданд.e Пептиди синтетикӣ бо miniSOG тозашуда дар ҳузури зонд 3 реаксия карда шуд ва маҳсулоти мувофиқ бо Δm +247 ва +229 дар спектри LC-MS қайд карда шуданд.f Таъсири мутақобилаи сафеда ба протеин дар in vitro бо miniSOG-6xHis-tag ва антитело анти-6xHis модел карда шудааст.Антибиотин (стрептавидин-HRP) ва таҳлили зидди муши Ғарбӣ аз комплексҳои антитело miniSOG-6xHis/anti-6xHis, ки бо зонд 3 ишора шудаанд, вобаста ба вақти рӯшноӣ.Тамғакоғазҳо барои сафедаҳои инфиродӣ дар вазни мувофиқи молекулавӣ ифода карда мешаванд: занҷири сабуки антитело LC, занҷири вазнини антитело HC.Ин таҷрибаҳо мустақилона ҳадди аққал ду маротиба бо натиҷаҳои шабеҳ такрор карда шуданд.
Барои санҷиши биохимиявии макони тамғагузорӣ, PRDX3 ва PRDX1, ки тавассути масс-спектрометрия муайян карда шудаанд, аз гистидин ба аланин иваз карда шуданд ва бо навъи ваҳшӣ дар таҳлилҳои трансфексия муқоиса карда шуданд.Натиҷаҳои PDPL нишон доданд, ки мутатсия тамғагузорӣ ба таври назаррас коҳиш ёфтааст (расми 2d).Дар ҳамин ҳол, пайдарпаии пептидҳо, ки дар ҷустуҷӯи кушод муайян шудаанд, синтез карда шуданд ва дар vitro бо miniSOG тозашуда дар ҳузури зонд 3 ва нури кабуд, ҳангоми муайян кардани LC-MS маҳсулот бо тағирёбии массаи +247 ва +229 Да ҳосил шуданд (расми 1). 2е).).Барои санҷидани он, ки оё протеинҳои проксималии мутақобилан метавонанд дар in vitro дар ҷавоб ба фотоактивизатсияи miniSOG тамғагузорӣ карда шаванд, мо як таҳлили наздикии сунъиро тавассути ҳамкорӣ байни протеини miniSOG-6xHis ва антиденои моноклоналии ӯ дар in vitro тарҳрезӣ кардем (Расми 2f).Дар ин таҳлил мо интизор будем, ки тамғагузории проксималии занҷирҳои вазнин ва сабуки антитело бо miniSOG.Дарвоқеъ, зидди муш (эътироф кардани занҷирҳои вазнин ва сабуки антителоҳои зидди 6xHis) ва стрептавидини ғарбӣ биотинилизатсияи қавии занҷирҳои вазнин ва сабукро нишон доданд.Қобили зикр аст, ки мо автобиотинилизатсияи miniSOG-ро аз ҳисоби теги 6xHis ва пайвандҳои байни занҷирҳои сабук ва вазнин мушоҳида кардем, ки метавонад ба холигии қаблан тавсифшуда байни вокуниши проксималии лизин ва 2-оксо-гистидин алоқаманд бошад.Хулоса, мо ба хулосае омадем, ки PDPL гистидинро ба таври вобаста ба наздикӣ тағир медиҳад.
Ҳадафи навбатии мо тавсифи протеомаи зерҳуҷайравӣ барои санҷиши хусусияти тамғагузории in situ буд.Аз ин рӯ, мо miniSOG-ро дар ядро, матритсаи митохондрия ё мембранаи берунии ER ҳуҷайраҳои HEK293T устуворона ифода кардем (расми 3а).Таҳлили флуорессенси гелӣ бандҳои фаровони тамғагузориро дар се макони зерҳуҷайра ва инчунин шаклҳои гуногуни тамғагузорӣ ошкор намуд (расми 3б).Таҳлили тасвири флуоресцентӣ хосияти баланди PDPL-ро нишон дод (расми 3c).Ҷараёни кории PDPL пас аз реаксияҳои клик бо рангҳои родамин барои муайян кардани протеомҳои зерҳуҷайра бо истифода аз микроскопияи флуоресцентӣ ва сигналҳои PDPL бо DAPI, трекерҳои митохондриалӣ ё трекерҳои ER якҷо карда шуданд, ки эътимоднокии баланди PDPL-ро тасдиқ мекунанд.Барои се макони органелл, муқоисаи паҳлӯ ба паҳлӯи PDPL бо TurboID бо истифода аз avidin western blot нишон дод, ки PDPL дар муқоиса бо назорати мувофиқи онҳо мушаххастар нишон дода шудааст.Дар шароити PDPL, бандҳои бештар нишондодашуда пайдо шуданд, ки сафедаҳои бештари PDPL-ро нишон медиҳанд (расми иловагӣ 6a-d).
Намоиши схематикии тамғагузории протеомҳои махсуси органеллҳои миёнаравии miniSOG.miniSOG матритсаи митохондрияро тавассути синтез ба N-терминали 23 аминокислотаҳои COX4 инсон (mito-miniSOG), ядро ​​тавассути синтез ба H2B (nucleus-miniSOG) ва Sec61β тавассути тарафи ситоплазми мембранаи ER (ER-miniSOG) ҳадаф қарор медиҳад. ).Нишондодҳо тасвири гел, тасвири конфокалӣ ва спектрометрияро дар бар мегиранд.б Тасвирҳои гели намояндагии се профили махсуси PDPL-и органелл.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Тасвирҳои конфокалии намояндагии ҳуҷайраҳои HEK293T, ки miniSOG-ро устуворона ифода мекунанд, бо локализатсияҳои гуногуни зерҳуҷайравӣ, ки аз ҷониби антитело бо нишони V5 (сурх) муайян карда шудаанд.Нишондиҳандаҳои зерҳуҷайравӣ барои митохондрия ва ER (сабз) истифода мешаванд.Ҷараёни кории PDPL муайян кардани протеомаҳои зериҳуҷайравии miniSOG (зард) бо истифода аз химияи клик Cy3-азидро дар бар мегирад.Сатри миқёс: 10 мкм.г Қитъаҳои вулқонии протеомаҳои бо PDPL нишондодашуда дар органеллҳои гуногун, ки бо миқдори нишондодашуда муайян карда шудаанд (n = 3 таҷрибаҳои мустақили биологӣ).Дар қитъаҳои вулқон озмоиши t-testи ду думдор Студент истифода шудааст.Навъи ваҳшӣ HEK293T ҳамчун назорати манфӣ истифода шуд. Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва >2 маротиба фарқияти шиддатнокии ионҳо). Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва >2 маротиба фарқияти шиддатнокии ионҳо). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ва >2-кратная разница дар интенсивности ионов). Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва фарқияти >2 маротиба дар шиддатнокии ион).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (р < 0,05 и > 2-кратная разница дар ионной силе). Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва > 2 маротиба фарқият дар қувваи ионӣ).Сафедаҳои марбут барои HEK293T-miniSOG муҳиманд, аммо барои HEK293T муҳим нестанд, бо ранги сабз нишон дода шудаанд.д Таҳлили хосияти маҷмӯи маълумотҳои протеомикӣ аз таҷрибаҳо г.Шумораи умумии сафедаҳои аз ҷиҳати оморӣ муҳим дар ҳар як органелл (нуқтаҳои сурх ва сабз) дар боло қайд карда мешавад.Гистограммаҳо сафедаҳои дар органеллҳо дар асоси MitoCarta 3.0, таҳлили GO ва A. Ting et al.одамон.Маҷмӯи додаҳои алоҳида барои митохондрия, ядроҳо ва ER.Ин таҷрибаҳо мустақилона ҳадди аққал ду маротиба бо натиҷаҳои шабеҳ такрор карда шуданд.Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумотҳои хом пешниҳод карда мешаванд.
Аз натиҷаҳои гел ва тасвир ташвиқ карда шуд, миқдорӣ бидуни тамғакоғаз барои муайян кардани миқдори протеомаи муайяншуда дар ҳар як органелл истифода шуд (Маълумоти иловагӣ 2).HEK293T трансфексиянашуда ҳамчун назорати манфӣ барои хориҷ кардани аломатҳои замина истифода шуд. Таҳлили қитъаи вулқон сафедаҳои ба таври назаррас бойшуда (p <0,05 ва >2-каратаи шиддатнокии ион) ва инчунин сафедаҳои синглтонро, ки танҳо дар хатҳои ифодакунандаи miniSOG мавҷуданд (расми 3d нуқтаҳои сурх ва сабз) нишон доданд. Таҳлили қитъаи вулқон сафедаҳои ба таври назаррас бойшуда (p <0,05 ва >2-каратаи шиддатнокии ион) ва инчунин сафедаҳои синглтонро, ки танҳо дар хатҳои ифодакунандаи miniSOG мавҷуданд (расми 3d нуқтаҳои сурх ва сабз) нишон доданд. Анализй графика вулкана показал значительно обогащенный белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), ва инчунин оддиочные белки, которые присутствуют тамоми линиях, экспрессирующих miniSOG (riss. tolko) . Таҳлили қитъаи вулқон сафедаҳои ба таври назаррас бойшуда (p<0,05 ва >2-каратаи шиддатнокии ион) ва инчунин сафедаҳои ягона, ки танҳо дар хатҳои ифодакунандаи miniSOG мавҷуданд (расми 3d, нуқтаҳои сурх ва сабз) нишон дод.火山图 分析 显示 显着 富集 的 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 (P <0.05 和 和 倍 倍 离子 离子 离子 离子 强度 强度 minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 蛋白质 (图 3D 单一).火山图 分析 显示 显着 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 語 蛋白质 蛋白质 (P <0.05 和 强度 强度 倍 离子 离子 强度 强度 强度 在于 在于 minisog 表达 系 的 在于 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 (图 3D 蛋白质 ...))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогощенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), ва монанди отделные белки, присутствующие только дар экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Таҳлили қитъаи вулқон сафедаҳои ба таври назаррас ғанишуда (p<0,05 ва >2x қувваи ионӣ) ва инчунин сафедаҳои ягонаро танҳо дар хати ифодаи miniSOG мавҷуданд (нуқтаҳои сурх ва сабз дар расми 3d) ошкор карданд.Якҷоя кардани ин маълумотҳо, мо мутаносибан 1364, 461 ва 911 сафедаҳои мембранаи берунии ядроӣ, митохондриалӣ ва ER-и аз ҷиҳати оморӣ муҳимро муайян кардем.Барои таҳлили дақиқии PDPL-и органелли маҳаллӣ, мо MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) таҳлил ва A. Ting et al.маҷмӯи маълумот8 барои митохондрия, ядро ​​ва ER барои санҷидани хосияти органеллҳои сафедаҳои ошкоршуда истифода шуд, ки ба дақиқии 73,4, 78,5 ва 73,0% мувофиқ аст (расми 3e).Хусусияти PDPL тасдиқ мекунад, ки PDPL воситаи беҳтарин барои муайян кардани протеомаҳои хоси органеллҳо мебошад.Қобили зикр аст, ки таҳлили субмитохондриалии сафедаҳои муайяншудаи митохондриалӣ нишон дод, ки протеомаи ҳабсшуда асосан дар матритса ва мембранаи ботинӣ тақсим шудааст (мутаносибан 226 ва 106), ки 91,7% (362) аз шумораи умумии сафедаҳои муайяншудаи митохондрияро ташкил медиҳад.сатҳи баланди PDPL ба таври иловагӣ тасдиқ карда шуд (Расми 7а).Ба ҳамин монанд, таҳлили зерядроӣ нишон дод, ки протеомаи гирифташуда асосан дар ядро, нуклеоплазма ва нуклеолҳо тақсим шудааст (расми 7б).Таҳлили протеомикии ядроӣ бо пептидҳои сигнали локализатсияи ядроӣ (3xNLS) дақиқии шабеҳро ба сохтори H2B нишон дод (Расми иловагӣ 7c-h).Барои муайян кардани хусусияти маркери PDPL, ламинини ядроии А ҳамчун доми локализатсияшудаи POI7 интихоб карда шуд.PDPL 36 сафедаи ба таври назаррас бойшударо муайян кард, ки аз онҳо 12 сафеда (30,0% аз он ҷумла ламини А) сафедаҳои хуб тавсифшудаи ламини А буданд, ки дар пойгоҳи додаҳои Стринг шарҳ дода шудаанд, бо фоизи баландтар аз усули BioID (122 сафеда) 28 аз 28. , 22.9 %) 7. Усули мо камтар сафедаҳоро муайян кард, эҳтимол аз сабаби маҳдуд будани минтақаҳои тамғагузорӣ, ки ин аз ҳисоби оксигени фаъолтари синглет имконпазир гардид.Таҳлили GO нишон дод, ки сафедаҳои муайяншуда асосан дар нуклеоплазма (26), мембранаи ядроӣ (10), мембранаи ядроӣ (9) ва сӯрохиҳои ядроӣ (5) ҷойгир шудаанд.Дар маҷмӯъ, ин сафедаҳои локализатсияшудаи ядроӣ 80% сафедаҳои ғанишударо ташкил медоданд, ки минбаъд хусусияти PDPL-ро нишон медиҳанд (Расми 8a-d).
Пас аз муайян кардани қобилияти PDPL барои анҷом додани аломатгузории наздикӣ дар органеллҳо, мо санҷидем, ки оё PDPL метавонад барои таҳлили шарикони ҳатмии POI истифода шавад.Аз ҷумла, мо кӯшиш кардем, ки таҳлили PDPL-и сафедаҳои ситозолиро муайян кунем, ки аз сабаби табиати хеле динамикӣ нисбат ба ҳамтоёни мембранаи маҳаллӣ ҳадафҳои мушкилтар ҳисобида мешаванд.Протеини бромодомен ва экстратерминалӣ (BET) BRD4 барои нақши калидии худ дар бемориҳои гуногун 35, 36 диққати моро ҷалб кардааст.Маҷмӯае, ки аз ҷониби BRD4 ташкил шудааст, коактиватори транскриптӣ ва ҳадафи муҳими табобатӣ мебошад.Бо танзими ифодаи омилҳои транскрипсияи c-myc ва Wnt5a, BRD4 ҳамчун муайянкунандаи асосии лейкемияи шадиди миелоидӣ (AML), миеломаи сершумор, лимфомаи Буркитт, саратони рӯдаи ғафс ва бемориҳои илтиҳобӣ37,38 ҳисобида мешавад.Илова бар ин, баъзе вирусҳо BRD4-ро барои танзими транскрипсияи вирусӣ ва ҳуҷайравӣ, ба монанди папилломавирус, ВИЧ ва SARS-CoV-236,39 ҳадаф қарор медиҳанд.
Барои харитаи ҳамкории BRD4 бо истифода аз PDPL, мо miniSOG-ро бо изоформаи кӯтоҳи N- ё C-терминали BRD4 муттаҳид кардем.Натиҷаҳои протеомикӣ дараҷаи баланди такрори байни ду сохторро ошкор карданд (расми 9а).Протеомаи ҳастаӣ, ки бо miniSOG-H2B муайян шудааст, 77,6% сафедаҳоеро, ки бо BRD4 мутақобила мекунанд, фаро мегирад (Расми 9б).Сипас, барои танзими радиуси маркер вақтҳои гуногуни равшанӣ (2, 5, 10, 20 дақиқа) истифода шуданд (расми 4а ва маълумоти иловагии 3).Мо ба хулосае омадем, ки дар фотодавраҳои кӯтоҳтар, PDPL асосан шарикони мустақими ҳатмиро нишон медиҳад, дар ҳоле ки давраҳои тӯлонӣ сафедаҳоеро дар бар мегиранд, ки дар давраҳои кӯтоҳтари фотоактивизатсия муайян карда мешаванд ва инчунин ҳадафҳои ғайримустақим дар комплексҳои тамғагузорӣ.Дарвоқеъ, мо дар байни нуқтаҳои ҳамшафати вақт такрори қавӣ пайдо кардем (84,6% барои 2 ва 5 дақиқа; 87,7% барои 5 ва 10 дақиқа; 98,7% барои 10 ва 20 дақиқа) (Расми 4b ва Расми 9c).Дар ҳама гурӯҳҳои таҷрибавӣ, мо на танҳо тамғагузории BRD4, балки якчанд ҳадафҳои маълумро, аз қабили MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ва HMGB1 дар пойгоҳи додаҳои сатр шарҳ додем.Қувваи ионии ин ҳадафҳо ба вақти таъсир мутаносиб аст (расми 4c ва расми иловагӣ 9d).Таҳлили GO сафедаҳои дар гурӯҳи 2 дақиқа муайяншуда нишон дод, ки сафедаҳои муайяншуда дар ядро ​​​​локализатсия шудаанд ва дар ремоделизатсияи хроматин ва функсияи полимеразаи РНК иштирок мекунанд.Функсияи молекулавии сафеда дар пайвастагии хроматин ё коактиватсияи транскриптӣ, ки бо функсияи BRD4 мувофиқ аст, бой карда шуд (расми 4d).Таҳлили мутақобилаи протеинҳо, ки дар асоси пойгоҳи додаҳо фаъол аст, сатҳи якуми мутақобилаи ғайримустақими байни комплексҳои мутақобилаи оилаи BRD4 ва HDAC ба монанди SIN3A, NCOR2, BCOR ва SAP130 (расми 4e ва расми иловагӣ 9e), ки бо гистонҳои ацетилонидашудаи BRD4 ва HDAC пайваст мешаванд, ошкор кард. ..Илова бар ин, ҳадафҳои намояндагӣ, ки аз ҷониби LC-MS/MS муайян шудаанд, аз ҷумла Sin3A, NSUN2, Fus ва SFPQ, тавассути blotting Western тасдиқ карда шуданд (расми 4f).Ба наздикӣ гузориш дода шудааст, ки изоформаи кӯтоҳи BRD4 ядроҳоро бо хосиятҳои ҷудошавии фазаи моеъ ва моеъ (LLPS) ташкил медиҳад.Протеинҳои RNA-и ҳатмии Fus ва SFPQ миёнаравии LLPS-и равандҳои гуногуни ҳуҷайра мебошанд ва дар ин ҷо ҳамчун сафедаҳои ҳатмии BRD4 сабтнашуда муайян карда шудаанд.Таъсири мутақобилаи BRD4 ва SFPQ бо таҷрибаҳои ко-иммунопреципиатсия (ко-IP) тасдиқ карда шуд (Расми 4g), ки механизми дигареро барои ҷудо кардани фазаи моеъ ва моеъи BRD4, ки сазовори таҳқиқи минбаъда аст, пешниҳод мекунад.Якҷоя, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки PDPL як платформаи беҳтарин барои муайян кардани мутақобилаи BRD4 ва инчунин сафедаҳои ҳатмии номаълум аст.
Намоиши схематикии аломатгузории наздикии BRD4, ки тавассути miniSOG миёнаравӣ аст, вақти экспозиция: 2, 5, 10 ва 20 дақиқа.б Пайвастани сафедаҳои дар вақтҳои гуногуни равшанӣ муайяншуда.Ғансозии сафеда, ки дар HEK293T-miniSOG-BRD4 муайян шудааст, дар муқоиса бо HEK293T-и ваҳшӣ аз ҷиҳати оморӣ муҳим буд.в Шиддати ионҳо ҳангоми муайян кардани миқдори протеинҳои ҳатмии BRD4-ро дар тӯли вақти муайяншуда нишондодашуда.n = 3 намунаҳои аз ҷиҳати биологӣ мустақил.Маълумот ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ пешниҳод карда мешавад.г Таҳлили генҳои онтологии (GO) сафедаҳое, ки дар гурӯҳи 2 дақиқа муайян карда шудаанд.Даҳ шарти аввали GO номбар шудаанд.Ҳубобҳо мувофиқи категорияи истилоҳи GO ранг карда мешаванд ва андозаи ҳубоб ба шумораи сафедаҳои дар ҳар як истилоҳ мавҷудбуда мутаносиб аст.e Таҳлили сатри сафедаҳо бо BRD4.Доираҳои зард ширеши мустақим ва доираҳои хокистарӣ қабати якуми ширеши ғайримустақим мебошанд.Хатҳои сурх таъсири мутақобилаи аз тариқи таҷриба муайяншуда ва хатҳои кабуд таъсири мутақобилаи пешбинишударо ифода мекунанд.f Ҳадафҳои ҳатмии намояндагии BRD4, ки дар LC-MS/MS муайян шудаанд, тавассути blotting Western тасдиқ карда шуданд.g Таҷрибаҳои муштараки иммунопреципиатсия таъсири мутақобилаи SFPQ ва BRD4-ро тасдиқ мекунанд.Ин таҷрибаҳо мустақилона ҳадди аққал ду маротиба бо натиҷаҳои шабеҳ такрор карда шуданд.Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумотҳои хом пешниҳод карда мешаванд.
Илова ба муайян кардани ҳадафҳои ба қайд гирифтанашудаи POI алоқаманд, мо тахмин мезанем, ки PDPL барои муайян кардани субстратҳо барои ферментҳо мувофиқ хоҳад буд, ки тавсифи сафедаҳои бавоситаро дар комплексҳои калон барои шарҳ додани субстратҳои сабтнашуда талаб мекунад.Паркин (бо PARK2 рамзгузорӣ шудааст) лигазаи E3 аст ва маълум аст, ки мутатсия дар паркин боиси бемории аутосомалии рецессивии ноболиғи Паркинсони (AR-JP) мегардад42.Илова бар ин, паркин ҳамчун муҳим барои митофагия (аутофагияи митохондриалӣ) ва хориҷ кардани намудҳои реактивии оксиген тавсиф шудааст.Аммо, гарчанде ки якчанд субстратҳои паркин муайян карда шудаанд, нақши паркин дар ин беморӣ норавшан боқӣ мемонад.Барои шарҳ додани субстратҳои номатлуби худ, PDPL тавассути илова кардани miniSOG ба N- ё C-терминали паркин санҷида шуд.Ҳуҷайраҳо бо интиқолдиҳандаи протони карбонилсианиди м-хлорофенилгидразон (CCCP) коркард карда шуданд, то паркинро тавассути роҳи PINK1-Parkin фаъол созанд.Дар муқоиса бо натиҷаҳои BRD4 PDPL мо, синтези паркин N-терминус маҷмӯи бештари сафедаҳои мақсаднокро ошкор кард, гарчанде ки он қисми бештари C-терминусро фаро гирифт (177 аз 210) (Расми 5a,b ва Маълумоти иловагии 4).натиҷа бо гузоришҳо мувофиқ аст, ки барчаспҳои N-терминалӣ метавонанд Parkin44-ро бетаъсир фаъол созанд.Тааҷҷубовар аст, ки дар маълумоти мо танҳо 18 сафедаи такроршаванда бо натиҷаҳои нашршудаи AP-MS барои Parkin43 мавҷуд буданд, ки эҳтимол аз фарқияти байни хатҳои ҳуҷайра ва ҷараёнҳои протеомика.Илова ба чор сафедаи маълум (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ва PSMC3), ки бо ду усул муайян карда шудаанд (расми 5c)43.Барои тасдиқи минбаъдаи натиҷаҳои LC-MS/MS, табобати PDPL ва blotting минбаъдаи ғарбӣ барои муқоисаи натиҷаҳои таҳлили ҳуҷайраи волидайни HEK293T ва хати устувори N-терминали паркин истифода шуданд.Ҳадафҳои қаблан номаълум CDK2, DUT, CTBP1 ва PSMC4 бо пайвандгари маълум, DNAJB1 озмуда шуданд (расми 5d).
Қитъаи вулқони сафедаҳои бо паркин бо ҳам таъсиркунанда дар ҳуҷайраҳои HEK293T бо miniSOG устувори ифодашуда ба N- ё C-терминуси паркин пайваст карда шудааст (n = 3 таҷрибаҳои мустақили биологӣ).Дар қитъаҳои вулқон озмоиши t-testи ду думдор Студент истифода шудааст.HEK293T ҳамчун назорати манфӣ истифода мешуд. Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва >2 маротиба фарқияти шиддатнокии ионҳо). Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва >2 маротиба фарқияти шиддатнокии ионҳо). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ва >2-кратная разница дар интенсивности ионов). Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва фарқияти >2 маротиба дар шиддатнокии ион).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (р < 0,05 и > 2-кратная разница дар ионной силе). Протеинҳои ба таври назаррас тағйирёфта бо ранги сурх қайд карда мешаванд (p <0,05 ва > 2 маротиба фарқият дар қувваи ионӣ).Сафедаҳои марбут барои HEK293T-miniSOG муҳиманд, аммо барои HEK293T муҳим нестанд, бо ранги сабз нишон дода шудаанд.б Диаграммаи Венн, ки сафедаҳои такроршавандаро байни сохторҳои N-терминалӣ ва C-терминалӣ нишон медиҳад.Тегҳои N-терминалӣ метавонанд паркинро бемаънӣ фаъол созанд ва боиси сафедаҳои бештар шинохташаванда шаванд.в Диаграммаи Венн, ки сафедаҳои такроршавандаро байни PDPL ва AP-MS нишон медиҳад.Интеракторҳои маълум номбар шудаанд, аз ҷумла 4 аз 18 сафедаи такроршаванда ва 11 аз 159 сафеда, ки махсусан дар PDPL муайян карда шудаанд.d Ҳадафҳои намояндагӣ, ки аз ҷониби LC-MS/MS муайян шудаанд, тавассути blotting Western тасдиқ карда шуданд.e Ssu72 ва SNW1 ҳамчун субстратҳои паркин ба қайд гирифта нашудаанд.Ин плазмидҳои сафеда бо нишони FLAG ба HEK293T ва HEK293T-Parkin-miniSOG трансфексия карда шуданд ва пас аз табобати CCCP дар нуқтаҳои гуногуни вақт.Деградатсия дар хати аз ҳад зиёди Паркин бештар зоҳир шуд.f Бо истифода аз ингибитори протеазом MG132, тасдиқ карда шуд, ки раванди таназзули Ssu72 ва SNW1 тавассути протеазома-убиквитинатсия миёнаравӣ мекунад.Ин таҷрибаҳо мустақилона ҳадди аққал ду маротиба бо натиҷаҳои шабеҳ такрор карда шуданд.Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумотҳои хом пешниҳод карда мешаванд.
Қобили зикр аст, ки сафедаҳое, ки аз ҷониби PDPL муайян шудаанд, бояд сафедаҳои паркин ва субстратҳои онҳоро дар бар гиранд.Барои ошкор кардани субстратҳои паркин ба қайд гирифтанашуда, мо ҳафт сафедаи муайяншударо (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ва SNW1) ва плазмидҳои трансфексияшударо интихоб кардем, то ин генҳоро ба HEK293T муқаррарӣ фош кунанд ва устувории миниSOG-Parkin-ро бо муолиҷаи HEK293CP паси сар кунанд.Сатҳи сафедаҳои Ssu72 ва SNW1 дар хати устувори miniSOG-Parkin ба таври назаррас коҳиш ёфт (расми 5e).Табобат бо CCCP дар тӯли 12 соат боиси таназзули назарраси ҳарду субстрат гардид.Барои тафтиш кардани он, ки оё таназзули Ssu72 ва SNW1 аз ҷониби протеазом-убикитинатсия танзим карда мешавад, ингибитори протеазом MG132 барои ҷилавгирӣ аз фаъолияти протеазом илова карда шуд ва дар асл мо дарёфтем, ки раванди таназзули онҳо монеъ шудааст (расми 5f).Ҳадафҳои иловагии ғайрисубстрат ҳамчун интерактивҳои Паркин бо истифода аз blotting Western тасдиқ карда шуданд (Расми 10), ки бо LC-MS/MS натиҷаҳои пайваста нишон доданд.Хулоса, ҳамгироии ҷараёни кории PDPL бо санҷиши интиқоли сафедаи ҳадаф имкон медиҳад, ки субстратҳои лигазаҳои E3 сабтнашуда муайян карда шаванд.
Мо як платформаи умумии аломатгузории наздикиро таҳия кардем, ки ба шумо имкон медиҳад, ки POI-ро дар фазо ва вақт муайян кунед.Платформа ба протеини фотосенсибилизатори miniSOG асос ёфтааст, ки ҳамагӣ тақрибан 12 кДа, камтар аз нисфи андозаи ферментҳои баркамол APEX2 (27 кДа) ва сеяки андозаи TurboID (35 кДа) мебошад.Андозаи хурдтар бояд доираи барномаҳоро барои омӯзиши интерактомҳои сафедаи хурд хеле васеъ кунад.Тадқиқоти минбаъдаи фотосенсибилизаторҳои иловагӣ, хоҳ сафедаҳои аз ҷиҳати генетикӣ рамзшуда ё молекулаҳои хурд, барои зиёд кардани ҳосили квантии оксигени синглет ва васеъ кардани ҳассосияти ин равиш лозим аст.Барои версияи кунунии miniSOG, бо истифода аз равшании кабуд барои фаъол кардани аломатҳои наздикӣ ҳалли баланди муваққатиро ба даст овардан мумкин аст.Илова бар ин, вақти тӯлонии таъсир "абр" -и калонтари оксигени синглро ба вуҷуд овард, ки дар натиҷа ба тағирёбии пасмондаҳои дисталии гистидин, зиёд шудани радиуси тамғагузорӣ ва қобилияти дуруст кардани ҳалли фазоии PDPL оварда мерасонад.Мо инчунин ҳафт зондҳои кимиёвиро барои баланд бардоштани таносуби сигнал ба замина озмоиш кардем ва механизми молекулавии паси ин равишро таҳқиқ кардем.Ҷараёни кории TOP-ABPP дар якҷоягӣ бо ҷустуҷӯи беғаразона тасдиқ кард, ки тағирот танҳо дар гистидинҳо ба амал омадаанд ва барои афзоиши тағирёбии гистидин, ба истиснои бартарии мӯътадил ба гистидинҳо дар минтақаи ҳалқа ягон микромуҳити пайваста мушоҳида нашудааст.
PDPL инчунин барои тавсифи протеомаҳои зерҳуҷайравӣ бо хусусияти протеомӣ ва фарогирии ҳадди аққал бо дигар тамғагузории наздикӣ ва усулҳои мушаххаси кимиёвии органелл муқоисашаванда истифода шудааст.Нишондиҳандаҳои наздикӣ инчунин барои тавсифи протеомаҳои рӯизаминӣ, лизосомалӣ ва секретомӣ бо муваффақият истифода мешаванд46,47.Мо боварӣ дорем, ки PDPL бо ин органеллҳои зерҳуҷайра мувофиқ хоҳад буд.Илова бар ин, мо PDPL-ро тавассути муайян кардани ҳадафҳо барои пайвастани сафедаи ситозолӣ, ки аз сафедаҳои бо мембрана алоқаманд мураккабтаранд, бо сабаби хосиятҳои динамикӣ ва ҷалби бештари мутақобилаи муваққатӣ.PDPL ба ду сафеда, коактиватори транскрипсияи BRD4 ва лигазаи бо беморӣ алоқаманд E3 Parkin татбиқ карда шуд.Ин ду сафеда на танҳо барои вазифаҳои асосии биологии худ, балки барои аҳамияти клиникӣ ва потенсиали табобатӣ интихоб карда шуданд.Барои ин ду POI шарикони маъруфи ҳатмӣ ва инчунин ҳадафҳои ба қайд гирифтанашуда муайян карда шуданд.Қобили зикр аст, ки сафедаи SFPQ бо ҷудошавии фаза аз ҷониби co-IP тасдиқ карда шуд, ки метавонад механизми наверо нишон диҳад, ки тавассути он BRD4 (изоформи кӯтоҳ) LLPS-ро танзим мекунад.Дар айни замон, мо боварӣ дорем, ки муайян кардани субстратҳои Паркин як сенарияест, ки дар он муайян кардани илтиёмҳои ғайримустақим зарур аст.Мо ду субстрати номаълуми паркинро муайян кардем ва таназзули онҳоро қад-қади роҳи ubiquitination-proteasome тасдиқ кардем.Ба наздикӣ, стратегияи ба механизм асосёфтаи ҳабс барои ошкор кардани субстратҳои гидролаза тавассути домани онҳо бо ферментҳо таҳия шудааст.Гарчанде ки ин усули хеле пурқувват аст, он барои таҳлили субстратҳое, ки дар ташаккули комплексҳои калон иштирок мекунанд, мувофиқ нест ва ташаккули робитаҳои ковалентии байни фермент ва субстратро талаб мекунад.Мо интизорем, ки PDPL метавонад барои омӯзиши дигар комплексҳои сафеда ва оилаҳои ферментҳо, ба монанди оилаҳои деубикитиназа ва металлопротеазҳо васеъ карда шавад.
Шакли нави miniSOG, ки SOPP3 ном дорад, бо истеҳсоли беҳтари оксигени синглӣ таҳия шудааст.Мо miniSOG-ро бо SOPP3 муқоиса кардем ва беҳтар шудани нишондодҳоро дарёфтем, гарчанде ки таносуби сигнал ба садо бетағйир монд (расми 11).Мо фарзия кардем, ки оптимизатсияи SOPP3 (масалан, тавассути эволютсияи нигаронидашуда) ба сафедаҳои самараноки фотосенсибилизатор оварда мерасонад, ки вақти камтари нурро талаб мекунанд ва ба ин васила имкон медиҳанд, ки равандҳои динамикии ҳуҷайравӣ ба даст оварда шаванд.Қобили зикр аст, ки версияи кунунии PDPL бо муҳити ҳуҷайра маҳдуд аст, зеро он равшании нури кабудро талаб мекунад ва наметавонад ба бофтаҳои амиқ ворид шавад.Ин хусусият истифодаи онро дар омӯзиши модели ҳайвонот манъ мекунад.Аммо, омезиши оптогенетика бо PDPL метавонад барои таҳқиқоти ҳайвонот, махсусан дар майна имконият фароҳам орад.Илова бар ин, дигар фотосенсибилизаторҳои муҳандисии инфрасурх низ ин маҳдудиятро бартараф мекунанд.Ҳоло дар ин самт таҳқиқот идома дорад.
Хати ҳуҷайраи HEK293T аз ATCC (CRL-3216) гирифта шудааст.Хатти ҳуҷайра барои сирояти микоплазма манфӣ санҷида шуд ва дар DMEM (Thermo, #C11995500BT) бо 10% хунобаи гови ҳомила (FBS, Vistech, #SE100-B) ва 1% пенициллин/стрептомицин (Hyclone, #SV30010) парвариш карда шуд.парвариш карда шудааст.
3-Аминофенилен (намунаи 3) ва (4-этинилфенил) метанамин (намунаи 4) аз Bidepharm харида шудаанд.Пропиламин (зонд 2) аз Energy-chemicals харида шуд.N-(2-Аминофенил)пент-4-намид (зонд 1) мувофиқи усулҳои нашршуда синтез карда шуд.
Ҷадвали иловагии 1 сохторҳои генетикии дар ин тадқиқот истифодашударо номбар мекунад.Пасиҳамоии miniSOG ва KillerRed аз плазми тӯҳфаи П.Зу (Донишгоҳи Пекин) клон карда шуданд.пайдарпаии ҳадафи матритсаи митохондриалӣ аз 23 аминокислотаҳои N-терминалии COX4 гирифта шуда, ба векторҳои зикршуда бо истифода аз маҷмӯи Гибсон клон карда шуд (Beyotime, #D7010S).Барои ҳадафи мембрана ва ядрои ретикулуми эндоплазма, ДНК-и инсон SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) тавассути PCR аз китобхонаи cDNA ҳуҷайраҳои HEK293T ва ДНК H2B (аз ҷониби Д. Лин, Лабораторияи Бэй Шенҷен тақдим карда шудааст) ва клон карда шудааст, тавре ки дар боло зикр гардид.Агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад, дигар генҳои сафедае, ки барои интиқол ва сохтани хатҳои устувори ҳуҷайра истифода мешаванд, аз китобхонаи cDNA ҳуҷайраҳои HEK293T пурзӯр карда шуданд.G3S (GGGS) ва G4S (GGGGS) ҳамчун пайвандкунанда байни протеини дом ва miniSOG истифода мешуданд.Ба ин конструксияҳои синтез теги эпитопи V5 (GKPIPNPLLGLDST) илова карда шуд.Барои ифода дар ширхӯрон ва таъсиси хати устувори ҳуҷайра, конструксияи синтези miniSOG ба вектори лентивирусии pLX304 зерклон карда шуд.Барои ифодаи бактериявӣ, miniSOG ба вектори pET21a клон карда шуд, ки 6xHis дар терминали C нишонгузорӣ шудааст.
Ҳуҷайраҳои HEK293T дар 2,0 x 105 ҳуҷайра дар як чоҳ дар лавҳаҳои шашчоҳ тухмипошӣ карда шуданд ва пас аз 24 соат бо плазмидҳои рекомбинатии лентививирусӣ (2,4 мкг pLX304) ва плазмидҳои бастабандии вирусӣ (1,5 мкг psPAX2 ва 1,2 мкг бо истифода аз LipoG02.02) трансфексия карда шуданд. , #C0533), тақрибан 80% омезиши.Пас аз трансфекцияи шабонарӯзӣ, муҳит иваз карда шуд ва барои 24 соати дигар инкубатсия карда шуд.Ҷамъоварии вирус пас аз 24, 48 ва 72 соат анҷом дода шуд.Пеш аз сирояти хатҳои ҳуҷайраҳои мақсаднок, муҳити вирусӣ тавассути филтри 0,8 мкм (Merck, #millex-GP) филтр карда шуд ва полибрен (Solarbio, # H8761) ба консентратсияи 8 мкг/мл илова карда шуд.Пас аз 24 соат, ҳуҷайраҳо имкон доданд, ки тавассути иваз кардани муҳити атроф барқарор шаванд.Ҳуҷайраҳо бо истифода аз 5 мкг/мл бластисидин (Solarbio, # 3513-03-9) барои се порчаи аввал ҳамчун интихоби қатъии камтар интихоб карда шуданд.Сипас 20 мкг/мл ҳамчун режими сахттар барои се гузариши оянда истифода бурда мешавад.
Ҳуҷайраҳо дар камераҳои 12-чоҳ (Ibidi, № 81201) бо зичии тақрибан 20,000 ҳуҷайра дар як чоҳ тухм карда шуданд.Барои беҳтар кардани часпидани ҳуҷайраҳои HEK293T, 50 мкг/мл фибронектин (Корнинг, #356008) илова кунед, ки дар шӯри фосфати буферӣ (PBS, Sangon, #B640435) дар 37°C ҳал карда шудааст.Камераҳо барои 1 соат пешакӣ коркард карда шуданд ва сипас бо PBS хориҷ карда шуданд.Пас аз 24 соат, ҳуҷайраҳо як маротиба бо PBS шуста, бо 1 мм проб 3 дар маҳлули тару тозаи намаки Ҳенкс (HBSS, Gibco, # 14025092) барои 1 соат дар 37 ° C инкубатсия карда шуданд ва сипас бо LED кабуд (460 нм) инкубатсия карда шуданд. ).) дар ҳарорати хонагӣ дар давоми 10 дақиқа шуоъ карда шуданд.Баъд аз ин, ҳуҷайраҳо ду маротиба бо PBS шуста шуданд ва бо 4% формальдегид дар PBS (Sangon, # E672002) барои 15 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ мустаҳкам карда шуданд.Формальдегиди зиёдатӣ аз ҳуҷайраҳои собит бо роҳи шустани се маротиба бо PBS хориҷ карда шуд.Пас аз он ҳуҷайраҳо бо 0,5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) дар PBS гузаранда шуданд ва 3 маротиба бо PBS шуста шуданд.Сипас камераро хориҷ кунед ва ба ҳар як намуна 25 мкл омехтаи реаксияи кликро илова кунед, ки дорои 50 мкМ Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) мебошад. ва 0,5 мг/мл аскорбати натрий (Аладдин, № S105024) ва 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда мешавад.Пас аз реаксияи фаврӣ, ҳуҷайраҳо шаш маротиба бо PBS дорои 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) шуста шуданд ва сипас бо 5% BSA (Abcone, #B24726) дар PBST барои 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ баста шуданд.
Барои ранг кардани иммунитети колокализатсия, ҳуҷайраҳо бо антителоҳои аввалия мувофиқи шароити нишондодашуда инкубатсия карда шуданд: теги муш зидди V5 mAb (1:500, CST, #80076), харгӯш зидди Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), антитело поликлоналии харгӯш зидди калнексин (1:500, Abcam, #ab22595) ё харгӯш антитело антиламин A/C моноклоналӣ (1:500; CST, #2032) дар 4 °C шабонарӯз.Пас аз шустани 3 маротиба бо PBST, ҳуҷайраҳо бо антителоҳои дуюмдараҷа инкубатсия карда шуданд: буз зидди харгӯш Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000, буз зидди муш Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:000.маҳлул Дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа маҳлул кунед.Пас аз он ҳуҷайраҳо 3 маротиба бо PBST шуста шуданд ва бо DAPI (Thermo, # D1306) дар PBS барои 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ муқовимат карданд.Пас аз 3 шустан бо PBS, ҳуҷайраҳо дар 50% глицерол (Sangon, # A600232) дар PBS барои тасвир мӯҳр карда шуданд.Тасвирҳои иммунофлуоресцентӣ бо истифода аз микроскопи конфокалии ZEISS LSM 900 Airyscan2 ва нармафзори ZNE 3.5 гирифта шуданд.
Барои тасвири флуоресцентии оксигени синглӣ, ҳуҷайраҳо ду маротиба бо буфери Hanks HEPES пеш аз илова кардани 100 нМ Si-DMA дар буфери Hanks HEPES шуста шуданд (DOJINDO, #MT05).Пас аз таъсири рӯшноӣ, ҳуҷайраҳо дар инкубатори CO2 дар 37 ° C барои 45 дақиқа инкубатсия карда шуданд.Сипас ҳуҷайраҳо ду маротиба бо буфери HEPES Hanks шуста шуданд ва бо Hoechst дар буфери HEPES Hanks барои 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ бо ранги конфокалии ZEISS LSM 900 визуалӣ карда шуданд., #M36008) дар буфери HBSS дорои калсий ва магний.Пас аз дучор шудан ба рӯшноӣ ё доксорубицин (MCE, #HY-15142A), ҳуҷайраҳо дар инкубатори CO2 дар 37 ° C барои 10 дақиқа инкубатсия карда шуданд, ду маротиба бо буфери HBSS шуста шуданд ва бо Hoechst дар буфери HBSS дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд.дақиқа.Доксорубицин ҳамчун назорати санҷиши мусбӣ истифода шуд, ки дар он ҳуҷайраҳо бо 20 мкм доксорубицин дар HBSS, ки дорои 1% BSA барои 30 дақиқа коркард карда шуданд.Тасвирҳои иммунофлуоресцентӣ бо истифода аз микроскопи конфокалии Zeiss LSM 900 гирифта шуданд.
Ҳуҷайраҳои HEK293T, ки устувори мито-miniSOG-ро ифода мекунанд, дар зичии тақрибан 30% дар зарфҳои 15 см тухмипошак карда шуданд.Пас аз 48 соат, вақте ки ба ~ 80% омезиш расид, ҳуҷайраҳо як маротиба бо PBS шуста, бо 1 mM Probe 3 дар буфери HBSS тару тоза дар давоми 1 соат дар 37 ° C инкубатсия карда шуданд ва сипас бо LEDи кабуд барои 10 дақиқа дар ҳуҷра равшан карда шуданд. ҳарорат..Пас аз он, ҳуҷайраҳо ду маротиба бо PBS шуста, канда шуданд ва дар буфери яхбандии PBS, ки дорои ингибиторҳои протеазҳои бе EDTA (MCE, #HY-K0011) мебошанд, боз карда шуданд.Ҳуҷайраҳо тавассути садои нӯги 1 дақиқа (1 сония фаъол ва 1 сония хомӯш бо амплитудаи 35%) лиз карда шуданд.Омехтаи натиҷавӣ дар 15,871 xg барои 10 дақиқа дар 4 ° C барои тоза кардани партовҳо центрифуга карда шуд ва консентратсияи супернатант бо истифода аз маҷмӯаи таҳлили сафедаи BCA (Beyotime, # P0009) ба 4 мг/мл тасҳеҳ карда шуд.1 мл лизати дар боло зикршударо бо азиди 0,1 мм фотодеградатсияшавандаи биотин (Конфлюор, # BBBD-14), 1 мм TCEP (Sangon, # A600974), 0,1 мм TBTA лиганд (Аладдин, # T162437) ва 1 mM SO4 incub бо SO4 якҷоя кунед. гардиш то 1 соат дар ҳарорати хонагӣ.Пас аз реаксияи фаврӣ, омехтаро ба маҳлули қаблан омехташуда (MeOH:CHCl3:H2O = 4 мл:1 мл:3 мл) дар шишаи 10 мл илова кунед.Намунаҳо омехта ва дар 4500 г дар давоми 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ центрифуга карда шуданд.Маҳлулҳои поёнӣ ва боло партофта шуданд, боришот ду маротиба бо 1 мл метанол шуста шуд ва дар 15871 × г барои 5 дақиқа дар 4 ° C центрифуга карда шуд.1 мл 8 М мочевина (Аладдин, № U111902) ба бикарбонати аммонийи 25 мм (ABC, Aladdin, № A110539) илова кунед, то боришотро ҳал кунед.Намунаҳо бо 10 мм дитиотреитол (Sangon, #A100281 дар 25 мм ABC) барои 40 дақиқа дар 55°C барқарор карда шуданд ва пас аз он илова намудани йодоацетамиди тару тозаи 15 мм (Sangon, #A600539) дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ.Алкилизатсия дар давоми 30 дақиқа..Барои боздоштани реаксия 5 мм дитиотреитоли иловагӣ илова карда шуд.Барои ҳар як намуна тақрибан 100 мкл маҳтоби агарози NeutrAvidin (Thermo, #29202) бо роҳи шустани 3 маротиба бо 1 мл PBS омода кунед.Маҳлули протеоми дар боло зикршуда бо 5 мл PBS илова карда шуд ва бо маҳтобҳои агарозии пеш аз шусташудаи NeutrAvidin барои 4 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуд.Пас аз он маҳтобҳо 3 маротиба бо 5 мл PBS дорои 0,2% SDS (Sangon, # A600485), 3 маротиба бо 5 мл PBS дорои 1М мочевина ва 3 маротиба бо 5 мл ddH2O шуста шуданд.Сипас маҳтобҳо тавассути центрифуга ҷамъоварӣ карда шуданд ва дар 200 мкл 25 мм ABC, ки дорои 1 М мочевина, 1 мМ CaCl 2 (Macklin, # C805228) ва 20 нг/мкл трипсин (Promega, # V5280) доранд, дубора боздошта шуданд.Trypsinize шабона дар 37 ° C бо гардиш.Реаксия бо илова кардани кислотаи формикӣ (Thermo, # A117-50) то ба 2-3 расидани рН қатъ карда шуд.Дандонҳоро 3 маротиба бо 1 мл PBS дорои 0,2% SDS, 3 маротиба бо 1 мл PBS, ки 1 М мочевина дорад ва баъд 3 маротиба бо 1 мл оби соф шуста шуданд.Пептидҳои тағирёфта тавассути лизи сабук (365 нм) барои 90 дақиқа бо истифода аз 200 мкл 70% MeOH озод карда шуданд.Пас аз центрифуга, супернатант ҷамъоварӣ карда шуд.Пас аз он маҳтобҳо як маротиба бо 100 мкл 70% MeOH шуста шуданд ва супернатантҳо ҷамъ карда шуданд.Намунаҳо дар консентраттори вакууми Speedvac хушк карда шуданд ва то таҳлил дар -20 ° C нигоҳ дошта шуданд.
Барои муайян ва миқдори пептидҳои тағирёфтаи оксигени синглӣ, намунаҳо дар кислотаи формикӣ 0,1% ҳал карда шуданд ва 1 мкг пептидҳо бо истифода аз спектрометри массаи Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, ки бо манбаи нано ESI аз Tune ва Xcalibur аз нармафзори фурӯшанда муҷаҳҳаз шудаанд, таҳлил карда шуданд.Намунаҳо дар сутуни капиллярии дарун печонидашудаи 75 мкм × 15 см бо маводи 3 мкм C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) ҷудо карда шуданд ва ба системаи EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo) пайваст карда шуданд.Пептидҳо бо хроматографияи хаттии градиентии 95 дақиқа аз ҳалкунандаи 8% В то 50% ҳалкунанда B (A = 0,1% кислотаи формикӣ дар об, B = 0,1% кислотаи формикӣ дар 80% ацетонитрил), сипас ба таври хаттӣ то 98% B дақиқа зиёд карда шуданд. дар 6 дақиқа бо суръати 300 нл/дақ.Orbitrap Fusion Lumos ба таври навбатӣ байни сканкунии пурраи MS ва сканкунии MS2 вобаста ба маълумот маълумот ҷамъ мекунад.Шиддати пошидан ба 2,1 кВ ва ҳарорати капиллярҳои интиқоли ионҳо 320°С буд.Спектрҳои MS (350-2000 м/з) бо қарори 120,000, AGC 4 × 105 ва вақти максималии вуруди 150 мс ҷамъоварӣ карда шуданд.10 прекурсорҳои маъмултарини зарбдори заряднок дар ҳар як скан пурра бо истифода аз HCD бо энергияи бархӯрди муқаррарии 30%, равзанаи изолятсияи чорқутбаи 1,6 м/з ва танзими ҳалли 30,000 тақсим карда шуданд.Ҳадафи AGC барои масс-спектрометрияи тандемӣ бо истифода аз 5×104 ва вақти максималии вуруд 150 мс.Истиснои динамикӣ ба 30 сония муқаррар карда шудааст. Ионҳои таъиннашуда ё зарядашон 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд. Ионҳои таъиннашуда ё зарядашон 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд. Неназначенные ион ё ион бо зарядом 1+ ва >7+ бо отклонены барои МС/МС. Ионҳо ё ионҳои таъиннашуда бо заряди 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ион ё иони с зарядами 1+ ва >7+ бо отклонены барои МС/МС. Ионҳо ё ионҳои номаълуми зарядашон 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд.
Маълумоти хом бо истифода аз платформаи ҳисоббарории FragPipe дар асоси MSFragger коркард карда мешавад.Мафҳуми масса ва аминокислотаҳои аминокислотаҳо бо истифода аз алгоритми ҷустуҷӯи кушод бо таҳаммулпазирии массаи прекурсорҳо аз -150 то 500 Да муайян карда шуданд.Пас аз он пептидҳои тағирёфта бо истифодаи тағироти гистидин бо афзоиши оммавии +229,0964 ва +247,1069 Да дар PD муайян карда шуданд (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ҳуҷайраҳое, ки гени муттаҳидшудаи miniSOG-ро устувор ифода мекунанд, дар зарфҳои 6 см ҷойгир карда шуданд.Пас аз расидан ба ~80% омезиш, ҳуҷайраҳо як маротиба бо HBSS (Gibco, #14025092) шуста шуданд, сипас бо зондҳои кимиёвӣ дар HBSS барои 1 соат дар 37 °C инкубатсия карда шуданд ва бо нури кабуд равшан карда шуданд.10W LED барои 20 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ.Барои муайян кардани кадом намуди оксигенҳои реактивӣ дар PDPL, 0,5 мм витамини C (MCE, #HY-B0166), 5 мм Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 мм маннитол (Energy Chemical, № 69-65-8), 100 мкм H2O2, 10 мм NaN3 ба ҳуҷайраҳо ҳамчун илова илова карда шуданд.Пас аз шустан бо PBS хунук, ҳуҷайраҳо канда шуданд, дар найҳои центрифугаи 1,5 мл ҷамъоварӣ карда шуданд ва бо нӯги 1 дақиқа дар 200 мкл PBS бо ингибитори 1х протеаз бе EDTA (1 сония ва 1 с бе, амплитуда 35%).Омехтаи натиҷавӣ дар 15,871 × г барои 10 дақиқа дар 4 °C центрифуга карда шуд ва консентратсияи супернатант бо истифода аз маҷмӯаи таҳлили сафедаи BCA ба 1 мг/мл тасҳеҳ карда шуд.Тақрибан 50 мкл лизати дар боло овардашуда бо азиди родамини 0,1 мм (Аладдин, № T131368), 1 мм TCEP, 0,1 мм лиганд TBTA ва 1 мм CuSO4 барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ бо гардиш аз поён ба боло инкуб карда шуд.Пас аз реаксияи клик, боришот бо ацетон тавассути илова кардани 250 мкл ацетони қаблан хунукшуда ба намунаҳо, дар -20 ° C барои 20 дақиқа инкубатсия ва центрифуга дар 6010 × г барои 10 дақиқа дар 4 ° C гузаронида шуд.Пеллетро ҷамъ кунед ва дар 50 мкл буфери 1x Laemmli барои 10 дақиқа дар 95 °C напазед.Сипас намунаҳо дар гелҳои дарози SDS-PAGE таҳлил карда шуданд ва бо истифода аз системаи тасвирии Bio-rad ChemiDoc MP Touch бо нармафзори Image Lab Touch визуалӣ карда шуданд.
Ифода ва тозакунии сафедаи рекомбинатии miniSOG-6xHis тавре ки қаблан тавсиф шудааст, анҷом дода шуд.Хулоса, ҳуҷайраҳои E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) бо pET21a-miniSOG-6xHis табдил дода шуданд ва ифодаи сафеда бо 0,5 mM IPTG (Sangon, # A600168) ба вуҷуд омад.Пас аз лизиси ҳуҷайра, сафедаҳо бо истифода аз маҳтобҳои агарози Ni-NTA (MCE, № 70666) тоза карда шуданд, бар зидди PBS диализ карда шуданд ва дар -80 ° C нигоҳ дошта шуданд.
Барои таҳлили наздикии тамғаи антитело дар асоси in vitro, 100 мкМ miniSOG тозашуда, 1 мМ зонд 3 ва 1 мкг антиденои моноклоналии мушро (TransGen, #HT501-01) дар PBS ба ҳаҷми умумии реаксияи 50 мкл омехта кунед..Омехтаи реаксия бо нури кабуди LED барои 0, 2, 5, 10 ва 20 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ шуоъ карда шуд.Омехта бо 0,1 мм биотин-PEG3-азид (Аладдин, # B122225), 1 мм TCEP, 0,1 мм лиганд TBTA ва 1 мм CuSO4 барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ дар ларзиши боло ҳаракат карда шуд.Пас аз реаксияи фаврӣ, 4х буфери Лаэммлиро мустақиман ба омехта илова кунед ва дар 95 ° C барои 10 дақиқа ҷӯшонед.Намунаҳо дар gels SDS-PAGE таҳлил карда шуданд ва бо роҳи blotting ғарбӣ бо стрептавидин-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) таҳлил карда шуданд.
Пептиди синтетикии дорои гистидин бо амидатсияи C-терминалӣ (LHDALDAK-CONH2) барои таҳлили тамғагузории in vitro дар наздикии пептид истифода шуд.Дар ин таҳлил, 100 мкМ miniSOG тозашуда, 10 мМ зонд 3 ва 2 мкг/мл пептидҳои синтетикӣ дар PBS дар ҳаҷми умумии реаксияи 50 мкл омехта карда шуданд.Омехтаи реаксия бо нури кабуди LED барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ шуоъ карда шуд.Як микролитр намуна бо истифода аз системаи LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight спектрометр бо нармафзори таҳлили спектри MassLynx) таҳлил карда шуд.
Ҳуҷайраҳои HEK293T, ки гени синтези miniSOG-ро устуворона ифода мекунанд, дар зарфҳои 10 см барои хатҳои локализатсияи органеллҳои гуногун (Mito, ER, Nucleus) ва зарфҳои 15 см барои хатҳои Parkin-miniSOG ва BRD4-miniSOG тухмипошакҳо гузошта шуданд.Пас аз расидан ба ~90% омезиш, ҳуҷайраҳо як маротиба бо HBSS шуста шуданд, сипас бо зонд 3 дар HBSS барои 1 соат дар 37 ° C инкубатсия карда шуданд ва бо LEDи кабуди 10 Вт дар ҳарорати хонагӣ равшан карда шуданд.Барои тамғагузории бидуни тамоси Паркин, интиқолдиҳандаи 10 мкМ протон карбонили сианид CCCP (Solarbio, #C6700) бо зонд 3 дар HBSS барои 1 соат дар 37°C илова карда шуд.Лизиси ҳуҷайра, химияи клик, қадамҳои коҳиш ва алкилизатсия ҳамон тавре буданд, ки дар боло тавсиф карда шудаанд, ба истиснои он, ки 2 мг лизат илова карда шуд ва дар реаксияи клик ба ҷои азиди фототаҷзияшаванда биотин азиди биотин PEG3 истифода шуд.Пас аз ғанисозӣ, маҳтобҳо 3 маротиба бо 5 мл PBS дорои 0,2% SDS, 3 маротиба бо 5 мл PBS дорои 1 М мочевина ва 3 маротиба бо 5 мл PBS шуста шуданд.Пас аз он, 2 мкг трипсин ба 300 мкл 25 мм ABC, ки дорои 1 М мочевина дорад, илова карда шуд, то сафеда дар як шабонарӯз дар 37 ° C ҷудо карда шавад.Реаксия бо илова кардани кислотаи формик то ба рН 2-3 расидан қатъ карда шуд.Пас аз трипсинизатсия дар маҳтобҳо, маҳлули пептид бо истифода аз сутуни SOLAµ HRP (Thermo, №60209-001) тоза карда шуд ва дар консентраттори вакууми Speedvac хушк карда шуд.Пептидҳо дар кислотаи 0,1% формикӣ дубора ҳал карда шуданд ва 500 нг пептидҳо бо истифода аз масс-спектрометри Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, ки бо манбаи нано-ESI дар боло тавсиф шудааст, таҳлил карда шуданд.Пептидҳо дар сутунҳои тиҷоратии RP-HPLC (75 мкм x 2 см) (Термо, № 164946) ва сутунҳои аналитикии RP-HPLC (75 мкм x 25 см) (Термо, № 164941), ҳарду бо 2 мкм пур карда шуданд.градиент аз 8% то 35% ACN дар 60 дақиқа, пас ба таври хаттӣ то 98% B дар 6 дақиқа бо суръати ҷараёни 300 Нл/дақ зиёд мешавад.Спектрҳои MS (350-1500 м/з) бо қарори 60,000, AGC 4 × 105 ва вақти максималии воридшавӣ 50 мс ҷамъоварӣ карда шуданд.Ионҳои интихобшуда аз ҷониби HCD дар 3 сония бо энергияи бархӯрди муқарраршуда 30%, равзанаи ҷудокунии чорқутба 1,6 м/з ва ҳалли 15000. Ҳадафи масс-спектрометри тандеми AGC 5 × 104 ва вақти максималии тазриқӣ пора-пора карда шуданд. 22 мс истифода шуд.Истиснои динамикӣ ба 45 сония муқаррар карда шудааст. Ионҳои таъиннашуда ё зарядашон 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд. Ионҳои таъиннашуда ё зарядашон 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд. Неназначенные ион ё ион бо зарядом 1+ ва >7+ бо отклонены барои МС/МС. Ионҳо ё ионҳои таъиннашуда бо заряди 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ион ё иони с зарядами 1+ ва >7+ бо отклонены барои МС/МС. Ионҳо ё ионҳои номаълуми зарядашон 1+ ва >7+ барои MS/MS рад карда шуданд.
Қадамҳои омодасозии намуна то ғанисозии маҳтобҳои NeutrAvidin ҳамон тавре буданд, ки дар таҳлили LC-MS/MS дар боло тавсиф карда шудаанд.Тақрибан 50 мкг лизат ҳамчун вуруд барои назорати боркунӣ ва 2 мг лизат барои аксуламалҳои клик истифода шудааст.Пас аз ғанисозӣ ва шустан бо нейтравидин, сафедаҳои пайвастшуда бо илова кардани 50 мкл буфери Лаэммли ба маҳтобҳои қатрони агароз ва дар 95 ° C барои 5 дақиқа ҷӯшонида шуданд.Вуруди сарбории назоратӣ ва намунаҳои ғанигардонидашуда аз ҷониби SDS-PAGE таҳлил карда шуданд ва ба мембранаҳои PVDF (Millipore, #ISEQ00010) бо усулҳои стандартии blot Western интиқол дода шуданд.Мембранаҳо бо шири 5%-и равған (Sangon, #A600669) дар TBS дорои 0,1% tween-20 (TBST) маҳкам карда шуданд ва пайдарпай бо антителоҳои ибтидоӣ ва дуюмдараҷа инкубатсия карда шуданд.Антителоҳои аввалия дар TBST дар шири 5% аз равған гирифташуда ба андозаи 1:1000 маҳлул карда шуда, шабона дар 4°С инкубатсия карда шуданд.Антителоҳои дуюмдараҷа дар таносуби 1:5000 истифода шуданд ва барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд.Мембранаҳо тавассути химилюминессенсия бо истифода аз системаи тасвирии Chemidoc MP визуалӣ карда шуданд.Ҳама сканҳои буриданашудаи доғҳо ва гелҳо дар расм ҳамчун маълумоти хом оварда шудаанд.
Антиденаҳои ибтидоии дар ин таҳқиқот истифодашуда антителоҳои моноклоналии харгӯш зидди SFPQ (CST, № 71992), антителоҳои моноклоналии харгӯш зидди FUS (CST, № 67840), антителоҳои поликлоналии харгӯш зидди NSUN2 (Proteintech, № 20854-1-) буданд. AP), антиденои поликлоналии харгӯш зидди mSin3A (Abcam, #ab3479), антиденои моноклоналии зидди тег (TransGen, #HT201-02), антиденои моноклоналии анти-β-актин муш (TransGen, #HC201-01), зидди харгӯш -Антиденои моноклоналии CDK2 (ABclonal, #A0094), антиденои моноклоналии харгӯш ба CTBP1 (ABclonal, #A11600), антитело поликлоналии харгӯш ба DUT (ABclonal, #A2901), антитело поликлоналии харгӯш ба PSMC4 (ABclonal #A2901), DNAJB1 антитело поликлоналӣ (ABclonal, # A5504).Ин антителоҳо дар 1:1000 маҳлул дар шири 5% аз равған дар TBST истифода мешуданд.Антиденаҳои дуюмдараҷае, ки дар ин таҳқиқот истифода шудаанд, дар бар мегирифтанд, ки зидди харгӯш IgG (TransGen, #HS101-01), зидди IgG муш (TransGen, #HS201-01) дар 1:5000 маҳлул карда шудаанд.
Барои таҳқиқи минбаъдаи он, ки BRD4 бо SFPQ ҳамкорӣ мекунад, ҳуҷайраҳои устувори HEK293T ва BRD4-miniSOG, ки аз ҳад зиёд HEK293T-ро ифода мекунанд, дар зарфҳои 10 см ҷойгир карда шуданд.Ҳуҷайраҳо бо PBS хунук шуста шуданд ва дар буфери лизиси 1 мл Пирс IP (Термо Фишер, # 87787) бо ингибитори протеазаи бидуни EDTA барои 30 дақиқа дар 4 ° C лизис карда шуданд.Баъд аз ин, лизатҳо дар найҳои центрифугаи 1,5 мл ҷамъ карда шуданд ва дар 15,871 xg барои 10 дақиқа дар 4 ° C центрифуга карда шуданд.Супернатант ҷамъоварӣ карда шуд ва бо 5 мкг антиденои моноклоналии муш (CST, # 80076) бо нишони зидди V5 дар як шабонарӯз дар 4°С инкубатсия карда шуд.Тақрибан 50 мкл протеинҳои магнитии A/G (MCE, #HY-K0202) ду маротиба бо PBS дорои 0,5% Tween-20 бишӯед.Сипас, лизатҳои ҳуҷайра бо маҳтобҳои магнитӣ барои 4 соат дар 4 ° C бо гардиш аз поён ба боло инкубатсия карда шуданд.Пас аз он маҳтобҳо чор маротиба бо 1 мл буфери PBST шуста шуда, дар 95 ° C барои 5 дақиқа ҷӯшонида шуданд.Намунаҳо дар гелҳои SDS-PAGE таҳлил карда шуданд ва бо истифода аз усулҳои стандартии Western blot ба мембранаҳои PVDF интиқол дода шуданд.Мембранаҳо дар шири 5% аз равған гирифташуда дар TBST маҳкам карда шуданд ва пайдарпай бо антителоҳои ибтидоӣ ва дуюмдараҷа инкубатсия карда шуданд.Антиденои ибтидоии харгӯш антиденои моноклоналии зидди SFPQ (CST, #71992) дар таносуби 1:1000 дар шири 5% аз равған дар TBST истифода шуда, шабона дар 4°С инкубатсия карда шуд.Анти-харгӯш IgG дар таносуби 1:5000 истифода шуд ва барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуд.Мембранаҳо тавассути химилюминессенсия бо истифода аз системаи тасвирии Chemidoc MP визуалӣ карда шуданд.
Ҳама сохторҳое, ки барои таҳлили майдони ҳалкунанда дастрас (SASA) истифода мешаванд, аз Бонки маълумотҳои сафедаҳо (PDB)52 ё пойгоҳи додаҳои сохтори сафедаҳои AlphaFold53 гирифта шудаанд.SASA-и мутлақ барои ҳар як боқимонда бо истифода аз барномаи FreeSASA ҳисоб карда шуд.Барои ба даст овардани миқдори миёнаи SASA барои ҳар як сохтор танҳо маълумоти пурра ва якхелаи SASA барои гистидини тамғагузорӣшуда ва ҳамсоягони он истифода шудааст.Дастрасии нисбии ҳалкунанда (RSA) барои ҳар як гистидин бо роҳи тақсим кардани арзиши мутлақи SASA ба масоҳати максималии имконпазири боқимондаҳои барои ҳалкунанда дастрас ҳисоб карда шуд.Пас аз он ҳама гистидинҳо ҳамчун пинҳон тасниф карда шуданд, агар RSA миёнаи камтар аз 20% бошад, дар акси ҳол фош карда шавад56.
Файлҳои хом, ки дар ҳолати DDA гирифта шудаанд, бо истифода аз Proteome Discoverer (v2.5) ё MSfragger (Fragpipe v15.0) дар махзани мувофиқи SwissProt протеини тасдиқшуда, ки дорои ифлоскунандаҳои маъмулӣ мебошанд, ҷустуҷӯ карда шуданд.Пептидҳо трипсинро пурра бо ду макони ҷудошавӣ, метилизатсияи карбамоил ҳамчун тағирёбии собит ва оксидшавии метионин ҳамчун тағироти динамикӣ талаб мекарданд.Таҳаммулпазирии вазни прекурсор ва фрагментҳо мутаносибан ба 10 ppm ва 0,02 Да (MS2 Orbitrap) муқаррар карда шуданд. Хитҳои ифлоскунанда хориҷ карда шуданд ва сафедаҳо филтр карда шуданд, то сатҳи кашфи бардурӯғ <1% -ро ба даст оранд. Хитҳои ифлоскунанда хориҷ карда шуданд ва сафедаҳо филтр карда шуданд, то сатҳи кашфи бардурӯғ <1% -ро ба даст оранд. Попадания загрязняющих веществ бо удаленӣ, як белки отфильтрованӣ, он аст, ки ҳосили баланд бардоштани ҳосилнокии он <1% аст. Хитҳои ифлоскунанда хориҷ карда шуданд ва сафедаҳо филтр карда шуданд, то сатҳи ошкоркунии бардурӯғ <1% -ро диҳад.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ бо удаленӣ, а белки отфильтровани барои дастрасии уровня ложных обнаружений <1%. Хитҳои ифлоскунанда хориҷ карда шуданд ва сафедаҳо филтр карда шуданд, то сатҳи мусбати бардурӯғро <1% ба даст оранд.Барои таҳлили миқдорӣ бидуни истифодаи тамғакоғазҳо, таркиби сафедаи муқарраршуда аз се такрори биологӣ истифода шудааст.Таҳлили маҳаллисозии зерҳуҷайраҳои сафеда бо истифода аз таҳлили Gene Ontology (GO) аз DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ва пойгоҳи додаҳо, ки аз ҷониби гурӯҳи Алиса Тинг таҳия ва нашр шудааст, анҷом дода шуд.Харитаи вулқон аз Персей гирифта шудааст (v1.6.15.0). Тағйироти қабати фаровонии сафедаҳо барои аҳамияти оморӣ бо истифода аз t-санҷи дуҷониба санҷида шуданд ва зарбаҳои сафеда бо тағирёбии фаровонӣ>2 (агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад) ва арзиши p <0,05 муайян карда шуданд. Тағйироти қабати фаровонии сафедаҳо барои аҳамияти оморӣ бо истифода аз t-санҷи дуҷониба санҷида шуданд ва зарбаҳои сафеда бо тағирёбии фаровонӣ>2 (агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад) ва арзиши p <0,05 муайян карда шуданд. Изменения кратности содержания белка бо проверены дар статистические значимость бо истифода аз ду критерия, ва совпадения белков бо идентификатсияи изменением содержания> 2 (если не указано иное) и з50, с. Тағироти қабати сафеда барои аҳамияти оморӣ бо истифода аз t-санҷи ду-думдор санҷида шуд ва мувофиқати сафедаҳо бо тағирёбии мундариҷа> 2 (агар тартиби дигаре қайд нашуда бошад) ва арзиши ap <0,05 муайян карда шуданд.使用 双边 t 双边 测试 蛋白质 倍数 变化 变化 的 的 统计 统计 统计 统计 显着性 显着性 统计 统计 命 命 中 中 中 的 丰度 丰度 变化 丰度 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化变化 (除非 有 说明) 和 p 值 <0.00.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 数 数 变化 的 统计 统计 显着性 显着性 显着性 确定 确定 确定 蛋白质 命 命 命 中 的 的 的 变化 变化 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0.0.0.. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли бо истифода аз ду критерия, а совпадения белков определяли барои изменений содержания >2 (если не указано иное) ва p-значений <0,05. Аҳамияти омории тағирёбии қабат дар таркиби сафедаҳо бо истифода аз t-санҷи ду думдор санҷида шуд ва мувофиқати сафедаҳо барои тағирёбии мундариҷа> 2 (агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад) ва қиматҳои p <0,05 муайян карда шуданд.Таҳлили мутақобилаи сафедаҳо бо истифода аз таҳлили GO дар якҷоягӣ бо пойгоҳи додаҳои String анҷом дода шуд.
Се такрори биологӣ бо натиҷаҳои шабеҳ гузаронида шуд.Таҳлили оморӣ бо GraphPad Prism (нармафзори GraphPad) анҷом дода шуд ва қитъаҳои вулқон бо Perseus (v1.6.15.0) тавлид карда шуданд.Барои муқоисаи ду гурӯҳ, арзишҳои p бо истифода аз t-testи дуҷонибаи Student муайян карда шуданд.Ба қитъаҳои вулқон танҳо сафедаҳои синглтонӣ, ки ҳадди аққал ду маротиба дар гурӯҳи таҷрибавӣ муайян карда шудаанд, дохил карда шуданд ва арзишҳои дахлдори дар гурӯҳи назоратӣ мавҷудбуда бо Персей аз тақсимоти муқаррарӣ иваз карда шуданд, то арзиши p-ро ҳисоб кардан мумкин бошад.Сутунҳои хатогӣ нишондиҳандаи миёна ± инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.Дар таҳлилҳои протеомикӣ барои таҳлили оморӣ, миқдори сафедаҳо, ки ҳадди аққал дар ду нусхаи биологӣ пайдо шудаанд, нигоҳ дошта шуданд.Усулҳои оморӣ барои пешакӣ муайян кардани андозаи интихоб истифода нашудаанд.Таҷрибаҳо тасодуфӣ нестанд.Муҳаққиқон ҳангоми таҷриба ва арзёбии натиҷаҳо аз иҷрои вазифаҳо нодида наистоданд.
Барои маълумоти бештар дар бораи тарҳрезии омӯзиш, ба реферат Ҳисоботи Тадқиқоти Табиат нигаред, ки ба ин мақола алоқаманд аст.
Маълумоти масс-спектрометрии дар ин таҳқиқот гирифташуда ба Консорсиуми ProteomeXchange тавассути анбори шарики iProX57 таҳти маҷмӯи додаҳои ID PXD034811 (маҷмӯи додаҳои PDPL-MS) пешниҳод карда шуд.Маълумоти хом дар шакли файлҳои маълумотҳои хом пешниҳод карда мешаванд.Ин мақола маълумоти аслӣ медиҳад.
Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Шинос шудан бо ҳамсоягӣ: истифодаи биотинилизатсияи ба наздикӣ вобаста барои тавсифи комплексҳои сафеда ва харитаи органеллҳо. Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Шинос шудан бо ҳамсоягӣ: истифодаи биотинилизатсияи ба наздикӣ вобаста барои тавсифи комплексҳои сафеда ва харитаи органеллҳо.Гинграс, АС, Абе, КТ ва Раут, Б. Шиносӣ бо муҳити атроф: бо истифода аз биотинилизатсияи наздикӣ барои тавсифи комплексҳои сафеда ва харитаи органеллҳо. Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并。 Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Фаҳмидани ҳамсоягӣ: вобастагии ҳамсояро аз ҳаёти биологӣ истифода баред.Гинграс, AS, Abe, KT ва Raut, B. Фаҳмидани наздикӣ: тавсифи комплексҳои сафеда ва харитаи органеллҳо бо истифода аз биотинилизатсияи аз наздикӣ вобаста.ҷорӣ.Фикри ман.химиявй.биология 48, 44–54 (2019).
Гери, ҶБ ва дигарон.Харитаи микромуҳити тавассути интиқоли энергияи Декстер ба ҳуҷайраҳои иммунӣ.Илм 367, 1091–1097 (2020).
Гертлинг, EL ва дигарон.Шабакаҳои миқёси ду протеомӣ таҷдиди ҳуҷайраҳои хоси интерактивии инсонро муайян мекунанд.Ҳуҷайраҳои 184, 3022–3040.e3028 (2021).